1 июня 1847 года Гельмгольц был переведен в королевский полк Gardes-du-Corps, находившийся также в Потсдаме. Гельмгольц познакомился с семейством Фельтон, глава которого был военным врачом. Молодая Ольга фон Фельтон, с которой Гельмгольц часто играл на рояле, читал стихи и участвовал в спектаклях, произвела на него неизгладимое впечатление, и 11 марта 1847 года он был с ней обручен. 30 сентября 1848 года, прослужив 6 лет военным врачом, Гельмгольц был произведен в старшие врачи. Александр Гумбольт помог Гельмгольцу освободиться от оставшихся трех лет обязательной службы и содействовал его назначению на место Брюкке в Академию художеств и анатомо-зоологический музей. Академия и Мюллер были этим очень довольны. Но едва лишь Гельмгольц освоился в новых условиях, как уже в следующем году его ожидало новое назначение.
Профессора Брюкке перевели на кафедру физиологии в Кёнигсбергский университет, и ему потребовался заместитель. Это мог быть или опытный Дюбуа-Реймон, или Гельмгольц. Но так как Дюбуа-Реймона, пока он занимался научной работой, отец еще мог содержать, то выбор пал на его друга — Гельмгольца. По рекомендации Мюллера Гельмгольца приглашают в 1849 году профессором физиологии в университет Кёнигсберга. В Кёнигсберге в процессе своих исследований он сконструировал ряд оригинальных измерительных приборов. Большое распространение в разнообразных областях физиологического исследования и медицины получили сконструированные им глазное зеркало (офтальмоскоп), который дал возможность наблюдать глазное дно, и так называемый маятник Гельмгольца, позволяющий подвергать ткань быстро следующим друг за другом раздражениям с точной дозировкой времени. И в настоящее время офтальмоскоп играет огромную роль при диагностике не только глазных болезней, но и нервных заболеваний, таких как опухоли мозга, сухотка спинного мозга и т. д.
Кёнигсбергский период научной деятельности Гельмгольца был наиболее продуктивным. Там же он развил физиологическую теорию слуха, по которой в основе способности животных и человека различать один звуковой тон от другого лежит явление резонанса. Звук определенной высоты приводит в колебательное движение не всю основную звуковую мембрану, а только какую-нибудь одну группу ее волокон, резонирующих на данную звуковую частоту. На основе физических законов резонанса Гельмгольцем создано учение о слуховой функции кортиева органа, находящегося во внутреннем ухе человека.
Труды Гельмгольца в области физиологии посвящены изучению нервной и мышечной систем. Он обнаружил и измерил теплообразование в мышце термоэлектрическим методом (1845–1847) и, пользуясь им же разработанной графической методикой, детально изучил процесс мышечного сокращения (1850–1854) в опытах на лягушке; гальванометрическое измерение малых интервалов времени (по баллистическому принципу). Тогда Гельмгольц задался этой целью, его учитель, Мюллер, засомневался в возможности измерить скорость прохождения возбуждения по нерву, то почти неизмеримо малое количество времени, когда человек почувствовал боль от ожога. За этот ничтожный промежуток времени возбуждение должно проделать известный путь по нервным проводникам. Как же измерить скорость передвижения возбуждений по нервам? Да и возможно ли это? Будучи искуснейшим из экспериментов, Гельмгольц взялся за разрешение этой задачи, предложив гениальное по простоте решение.
Он подводил электрический ток к нерву лягушки у какой-либо ее мышцы. Ток возбуждал нерв, мышца отвечала на это раздражение сокращением. Затем он раздражал электрическим током тот же нерв не у самой мышцы, а на некотором расстоянии от нее. Мышца снова сокращалась, но несколько позднее, чем в первый раз. Эта разность во времени, разделенная на длину участка нерва между двумя точками, где прикладывалось электричество, показывала скорость, с которой раздражение прошло по нерву. У лягушки, на которой был проведен Гельмгольцем этот эксперимент, скорость распространения возбуждения по нервам оказалось равной 27 метрам в секунду. Как отличалась эта сравнительно небольшая скорость от той фантастической цифры, которую называли ученые! Предполагали, что скорость движения возбуждения по нервам равна скорости света — 300 тысяч километров в секунду!
В 1867–1870 годах совместно с русским ученым Н. Бакстом он измерил скорость распространения возбуждения в нервах у человека. Ряд исследований ученого относится к физиологии центральной нервной системы. Он впервые определил в 1854 году скрытый период рефлексов, сделал первую экспериментальную попытку определить ритмику импульсов, посылаемых мозгом к мышце (1864–1868), количественными методами определил скрытый период волевой мышечной реакции на раздражение органов чувств.