Если в Лондонском университетском колледже было 60 хирургических коек, то в Эдинбургском госпитале — 200. Воодушевлял молодых хирургов доктор Сайм, которому было 54 года. Уже через месяц своего пребывания в Эдинбурге Листер стал постоянным помощником Сайма во время операций. Вскоре освободилось место штатного ассистента, и Сайм предложил его Листеру. После этого Листер уже самостоятельно производил все несложные операции, и у него к тому времени было 12 помощников. Нередко Листер демонстрировал операции студентам. 7 ноября 1855 года Листер занял место Сайма и стал читать курс по основам хирургии. В апреле 1856 года Листер женился на дочери Сайма, Агнессе.
Между тем в университете Глазго освободилась кафедра хирургии, и один из тамошних профессоров попросил Сайма рекомендовать достойного кандидата. Хотя Сайму было жаль расставаться со своим помощником, он предложил Листера, который 9 марта 1860 году был утвержден профессором хирургии. Возведение Листера в профессорский сан сопровождалось особой церемонией: Листер должен был перед собранием профессоров прочитать на латинском языке доклад «О хирургическом образовании» и подписать обязательство, что не будет предпринимать ничего во вред шотландской церкви. В августе 1861 года Листер был назначен хирургом в госпиталь Глазго. С тех пор в полной мере развернулась научная деятельность Листера, приведшая его к разработке новых методов оперативной техники: усовершенствовал технику резекции лучезапястного сустава при туберкулезе, ввел в качестве материала для швов антисептический рассасывающий кетгут и т. п. Ему принадлежат также работы по анатомии, гистологии и микробиологии; впервые описал мышцы радужной оболочки глаза, расширяющие и суживающие зрачок, открыл bacterium lactis — возбудителя молочнокислого брожения.
В 1869 году Сайма, учителя и тестя Листера, разбил паралич, и хотя он вскоре оправился, тем не менее не смог вернуться к работе. Сайм предложил свое место Листеру, который во второй раз стал профессором хирургии в Эдинбурге. Особое внимание заслужил Листер после того, как занялся вопросами антисептики.
В течение долгого времени хирурги рассматривали нагноение как нормальное явление при заживлении ран. Они стремились добиться не первичного натяжения, а pus bunut et laudabile («хорошего и желательного нагноения»). Лишь в том случае, если нагноение принимало гнилостный характер, хирурги настораживались. «Хорошее» нагноение их нисколько не тревожило. Только в XIII веке этот взгляд изменился под влиянием итальянской хирургической школы, во главе которой стоял знаменитый хирург Гуго Боргоньони. Он утверждал, что для лечения ран необходимо первичное натяжение без нагноения, и предложил особую алкогольную повязку. Таким образом, Боргоньони — один из первых предшественников Листера, основателя антисептической хирургии.
На дальнейшее развитие хирургии, особенно в Англии, повлиял кумир Листера, выдающийся врач своего времени Джон Гунтер (Hunter, 1718–1793) — брат Вильяма Гунтера. Сначала он был плотником, потом помощником брата, затем военным врачом и, наконец, главным хирургом всей английской армии и главным инспектором военных госпиталей. Дж. Гунтер — сторонник анатомического направления в хирургии; он один из основателей экспериментальной патологии, постоянно искавший тесную связь физиологии с патологией. Особенно важна его работа по изучению условий изменения крови и происхождения гноя при ранениях. В учении Гунтера получила теоретическое обоснование точка зрения Бороньони о борьбе с нагноением ран.
В науке господствовал взгляд, что истинной причиной разложения и нагноения является кислород. Когда же Пастер опроверг убеждение Либиха, что кислород является причиной нагноения, и доказал, что истинная причина — мельчайшие живые существа, находившиеся в воздухе, открылись широкие возможности для антисептики. В 1866 году, уже зная, что всякая инфекция связана с наличием микробов, которые заносятся из воздуха, Листер решил оградить раны от патогенных микробов, чтобы избавиться от «больничной инфекции». Друг Листера Андерсен, знакомый с трудами Пастера, доставил ему образец сырой карболовой кислоты, которая применялась для дезинфекции сточных вод. Листер применил ее в лечении сложных переломов.