В 1874 г. в качестве ассистента он последовал за своим учителем Кундтом в Страсбургский университет и начал научно-практическую деятельность. Спустя год он сдал экзамены на право преподавания физики и математики и стал профессором Высшей сельскохозяйственной школы в Гогенгейме. Через год вернулся в Страсбург, а в 1879 г. по рекомендации Г. Гельмгольца получил место профессора в Гессенском университете, в котором работал до 1888 г., отказавшись от предложений занять кафедру физики в университетах Иены и Утрехта.
Здесь Рентген, занимаясь в основном вопросами электромагнетизма и оптики, сделал очень важное открытие: основываясь на электродинамике Фарадея – Максвелла, обнаружил магнитное поле движущегося заряда (так называемый «рентгенов ток»). Среди других работ этого периода – исследование свойств жидкостей, газов, электромагнитных явлений, открытие взаимосвязи электрических и оптических явлений в кристаллах кварца.
В 1888 г. Вильгельм был приглашен в университет баварского города Вюрцбурга, расположенного на юге Германии, а спустя шесть лет стал его ректором. В стенах этого университета 8 ноября 1895 г. он сделал открытие, которое принесло ему всемирную известность. Именно тогда 49-летний профессор приступил к экспериментальным исследованиям электрического разряда в стеклянных вакуумных трубках. Около полуночи 8 ноября 1895 г. ученый, уже почувствовав усталость, собрался уходить, но, окинув последним взглядом лабораторию, вдруг заметил в темноте какое-то светящееся пятно. Оказывается, светился экран из синеродистого бария. Почему он светится? Рентген еще раз посмотрел на катодную трубку и упрекнул себя: забыл выключить. Нащупав рубильник, ученый обесточил ее и свечение экрана исчезло; включил – вновь появилось… Значит, свечение вызывает катодная трубка! Оправившись от минутного изумления и забыв об усталости, Рентген тут же стал исследовать обнаруженное явление и новые лучи, названные им Х-лучами (как известно, в математике через «х» обозначается неизвестная величина).
Оставив футляр на трубке, чтобы катодные лучи были закрыты, он с экраном в руках начал передвигаться по лаборатории. Тут же выяснилось, что полтора-два метра для этих неизвестных лучей не преграда, они легко проникают через книгу, стекло, станиоль… А когда рука ученого оказалась на пути неизвестных лучей, он увидел на экране силуэт ее костей! Фантастично и жутковато! Рентген заторопился: необходимо было закрепить увиденное на снимке. Так начался новый эксперимент, который показал, что лучи засвечивают фотопластинку и имеют определенное направление. Только утром обессиленный ученый ушел домой. «Великий жребий», который ему выпал, как позднее сказал Рентген, он поспешил подкрепить «безупречными результатами исследований». На пятьдесят дней и ночей было забыто все: семья, здоровье, ученики и студенты… Он никого не посвящал в свою работу до тех пор, пока не разобрался с их отражением, поглощением, способностью ионизировать воздух. Рентген велел приносить себе пищу в университет и поставить там кровать, чтобы избежать сколько-нибудь значительных перерывов в работе. Первым человеком, кому он продемонстрировал свое открытие, была его жена Берта. Именно снимок ее кисти, с обручальным кольцом на пальце, ученый приложил к статье «О новом роде лучей», которую он 28 декабря 1895 г. направил председателю Физико-медицинского общества университета и известил о своем достижении императора Вильгельма II.
Уже через 10 дней на заседании Научного физико-медицинского общества было рассмотрено сообщение об открытии Рентгена. Он попросил разрешения у советника фон Колликера «просветить X-лучами» его руку. Сразу же была сделана фотография, и все присутствующие смогли воочию убедиться в «волшебном» действии «невидимых лучей». После этого «подопытный» предложил назвать эти лучи именем Рентгена.