Биология. В 3-х томах. Т. 1

Рис. П.1.8. Методы хроматографии

П.1.8.2. Двухмерная бумажная хроматография

Хроматографией, идущей только в одном направлении, не всегда можно эффективно разделить сложную смесь веществ. В этом случае для лучшего разрешения пятен должно быть проведено дополнительное разделение в перпендикулярном направлении с использованием второго растворителя (рис. П.1.8, Г).

Для этого используют квадратный лист бумаги. Образец наносят на базовую линию около одного из углов и проводят разделение в первом направлении. Бумагу вынимают из камеры, сушат, поворачивают на 90° и проводят повторное хроматографическое разделение, используя другой растворитель. В результате вещества, частично разделенные после первого пробега, окончательно разделяются во втором растворителе, имеющем отличные от первого характеристики. Бумагу вынимают, сушат и выявляют разделенные вещества соответствующим реактивом. Идентифицировать данное вещество можно, сравнив его местоположение с положением известных стандартных веществ. Такой метод использовал Кальвин в экспериментах по идентификации первичных продуктов фотосинтеза (разд. 9.1.3).

Прежде чем начать хроматографию веществ, которые вам необходимо идентифицировать, следует попрактиковаться в этом, используя цветные чернила или индикаторы. Проведя опыты, которые описаны ниже, вы убедитесь, что чем концентрированнее стартовое пятно, тем лучше пройдет разделение. Вы убедитесь также в том, что разделение проходит лучше при более длинном хроматографическом пробеге.

Опыт П.1.1. Разделение индикаторов

Материалы и оборудование

Хроматографическая бумага ватман № 1 или № 3

Метиловый оранжевый (защищенный)

Бутылка с аммиаком 880

Чашка Петри

Пипетка

Методика

Нанесите каплю защищенного метилового оранжевого в центр хроматографической бумаги. Высушите бумагу, помахав ею в воздухе, немного подержите ее над открытой бутылкой аммиака 880 и затем положите на чашку Петри (рис. П.1.8, А). Капните одну каплю воды на пятно индикатора.

Наблюдаемый эффект

Два индикатора, содержащиеся в растворе метилового оранжевого, двигаются центробежно с разными скоростями, причем синее кольцо двигается быстрее желтого. Синее кольцо — это индикатор бромтимоловый синий, а желтое — метиловый оранжевый.

Опыт П.1.2. Разделение цветных чернил на составляющие компоненты

Материалы и оборудование

Лабораторная пробирка

Пробка

Хроматографическая бумага

Канцелярская кнопка

Фломастеры

Дистиллированная вода

Методика

1. Возьмите пробирку и пробку (см. рис. П.1.8, Б) и прикрепите прямоугольник из хроматографической бумаги к пробке с помощью кнопки. Параллельно свободному концу хроматографической бумаги на расстоянии примерно 1 см от края проведите карандашом линию.

2. Разметьте стартовую линию крестиками через равные интервалы; на каждый цвет чернил должно приходиться по одному крестику.

3. Фломастерами с водорастворимыми чернилами разных цветов нанесите на каждый крестик по пятну чернил разного цвета и под каждым пятном отметьте его местоположение карандашом. Пятно должно быть не более 2 мм в диаметре. Высушите пятна.

4. Подвесьте бумагу в пробирке таким образом, чтобы стартовая линия находилась около поверхности растворителя, а конец бумаги был погружен в растворитель. Растворителем служит дистиллированная вода.

5. Продолжайте хроматографию до тех пор, пока фронт растворителя не окажется на расстоянии 1 см от верхнего края бумаги. Выньте хроматограмму и высушите ее, предварительно отметив карандашом положение фронта растворителя.

6. Если имеются хроматографические камеры большого размера, то их можно использовать как для восходящей, так и для нисходящей хроматографии.

Опыт П.1.3. Разделение растительных пигментов при помощи бумажной хроматографии

Материалы и оборудование

Листья крапивы или шпината

Гомогенизатор или нож

90% пропанон (ацетон)

Ступка с пестиком

Небольшой отрезок капиллярной трубки

Воронка Бюхнера

Делительная воронка

Петролейный эфир (темп, кипения 37,8-48,9°С)

Лабораторная пробирка

Канцелярская кнопка

Методика