ДНК и её человек. Краткая история ДНК-идентификации

В итоге отобрали хорошо сохранившиеся участки бедренных костей, которым при нахождении были присвоены номера 146 и 147. Кроме того, для повторного исследования взяли костные фрагменты из первого захоронения, принадлежавшие Николаю II, императрице Александре, Ольге, Татьяне и Анастасии (соответственно 4, 7, 3, 5, 6). Небольшие количества (как правило, сотни миллиграммов) костной ткани тщательно очищали от возможных загрязнений и размалывали в порошок. Верхнюю часть костных фрагментов всегда удаляли, что само по себе было непростой задачей: удалить слишком много – потерять драгоценный материал, удалить мало – рисковать загрязнением.

Затем проводили экстракцию ДНК. От успеха на этом этапе зависела судьба всего исследования. Поэтому все процедуры велись со строжайшим соблюдением стерильности, со всеми мыслимыми контролями, в помещениях, где ранее не работали с человеческой ДНК, а саму экстракцию для каждого образца повторяли несколько раз. Необходима была полная уверенность, что будет амплифицироваться и секвенироваться именно ДНК членов царской семьи, а не кого-то из наших современников. Для вящей достоверности экстракцию проводили в двух разных научных центрах: в московском Институте общей генетики РАН и в Медицинской школе университета Массачусетса.

Человеческая ДНК составляла менее процента от общего количества, выделенного из образцов 146 и 147, остальное – ДНК микроорганизмов. Но это не помешало дальнейшей работе: системы анализа митохондриальной ДНК, Y-хромосомы и неполовых хромосом ориентированы на последовательности, специфичные для человека, они просто “не замечают” ДНК других видов. Иначе судмедэксперты столкнулись бы с непреодолимыми трудностями даже при расследовании рутинных уголовных дел.

Если сравнить, как это часто делают, секвенирование ДНК с чтением книги, то в данном случае перед исследователями были обожженные клочки страниц. К счастью, не предполагалось, что текст этих книг совершенно уникален и доселе не читался (в отличие, например, от геномов ископаемых видов). Большинство генов у всех людей одинаковы, индивидуальные отличия составляют доли процента, да и многие вариации подчиняются известным закономерностям. Методы идентификации человека и установления родственных связей по ДНК в то время были прекрасно отработаны. Тем не менее случай был исключительно трудным, к тому же работе заранее было обеспечено повышенное внимание общественности и как следствие – повышенные требования к качеству результатов.

Митотип королевы Виктории, Y-хромосома дома Романовых и рубаха из Эрмитажа

Естественно, и Рогаев с соавторами анализировали митохондриальную ДНК: она сохраняется лучше ядерной, и по ней существуют обширные базы данных, показывающие популяционную изменчивость. В первую очередь нужно было секвенировать гипервариабельные участки – HVR1 и HVR2, в которых сосредоточено особенно много индивидуальных различий, – и убедиться, что с полученной ДНК вообще можно работать. Последовательности ДНК из образцов 146 и 147 буква в букву совпали с образцами 7, 3, 5, 6, а также с ранее опубликованной мтДНК принца Филиппа.

Успех вдохновил исследователей на смелую идею: почему бы не реконструировать полную последовательность митохондриальной ДНК царицы и ее детей? И это было сделано. Разработали специальные праймеры для амплификации отдельных перекрывающихся участков мтДНК. Существующие методики не годились, так как не были рассчитаны на амплификацию ДНК, состоящей из обрывков. Пришлось использовать много хитрых приемов, уменьшающих вероятность потери какого-либо фрагмента. В итоге для образцов 7, 146 и 147 (царица, Мария и Алексей) удалось получить полную последовательность митохондриальной ДНК длиной 16 571 нуклеотид.

Митохондриальная ДНК Александры Федоровны и ее детей – это, как мы уже говорили, мтДНК королевы Виктории, “бабушки королей”. И чтобы окончательно убедиться в достоверности результата, следовало сравнить полученную последовательность с мтДНК ныне живущих потомков Виктории по женской линии – детей ее дочек, внучек и правнучек.