Интернет-журнал "Домашняя лаборатория", 2008 №1

Суспензионные культуры широко используются в качестве модельных систем для изучения путей вторичного метаболизма, индукции ферментов и экспрессии генов, деградации чужеродных соединений, цитологических исследований и др.

Признаком "хорошей" линии служит способность клеток к перестройке метаболизма и высокая скорость размножения в конкретных условиях культивирования. Морфологические характеристики такой линии:

— высокая степень дезагрегации (5-10 клеток в группе);

— морфологическая выравненность клеток (небольшие размеры, сферическая или овальная форма, плотная цитоплазма);

— отсутствие трахеидоподобных элементов.

Клеточную суспензию получают, помещая каллусную ткань в колбу с жидкой питательной средой. Суспензия перемешивается в колбе на качалке, имеющей скорость перемешивания 100–120 об/мин. При первом переносе на свежую среду удаляют крупные кусочки исходного каллуса и крупные агрегаты, фильтруя через 1–2 слоя марли, нейлоновые сита, шприц с соответствующим отверстием. Для инициализации суспензионной культуры необходимо 2–3 г свежей массы каллусной культуры на 60-100 мл жидкой питательной среды. Однако для каждой линии культуры клеток существует минимальный объем инокулята, при меньшем размере которого культура не растет.

Рост суспензионных культур клеток можно оценивать по одному или нескольким следующим параметрам:

1. Объем осажденных клеток (ООК).

Переносят небольшой объем суспензионной культуры в мерную пробирку объемом 15 мл, лучше всего коническую. Центрифугируют 5 минут при 200 д. ООК — величина, которую составляет объем осадка от объема суспензии, обычно в %.

2. Число клеток. Подсчитывается в камере Фукса-Розенталя.

3. Сырая и сухая масса. Суспензия клеток фильтруется через смоченный и взвешенный фильтр, вложенный в воронку Бюхнера под слабым вакуумом. Клетки промывают дистиллированной водой, оттягивают воду под вакуумом и взвешивают снова вместе с фильтром. Сухая масса — определяется аналогично, но взвешивается сухой фильтр, а клетки сушат вместе с фильтром в термостате при 60 °C до постоянной массы.

4. Содержание белка. Для определения белка клетки собирают на фильтре из стекловолокна, дважды промывают кипящим раствором 70 % этанола, сушат ацетоном, гидролизуют 1М NaOH при температуре 85 °C полтора часа. Затем фильтруют и определяют белок по Лоури.

5. Проводимость среды.

Определяют с помощью кондуктометра. Как правило, она обратно пропорциональна свежей массе клеток.

6. Жизнеспособность клеток. Оценивают, изучая движение цитоплазмы под микроскопом, а также с помощью прижизненных красителей (флюоресцеиндиацетат, соли тетразолия, синий Эванса). Перед использованием подбирают pH инкубационного буфера, концентрацию красителя, время инкубации, строят калибровочные кривые для смеси живых и убитых клеток.

По полученным данным строят ростовые кривые, которые имеют S-образную форму и состоят из нескольких участков: 1 — латентная, или лаг-фаза, где видимый рост не наблюдается ни по одному из критериев; 2 — экспоненциальная, рост с ускорением; 3 — линейная, где скорость роста постоянна; 4 — фаза замедленного роста; 5 — стационарная фаза; 6 — фаза деградации клеток (рис. 11)^[68].

Реальная ростовая кривая может несколько отличаться от модельной. На форму ростовых кривых влияют и генетическая характеристика популяции (вид растения), и количество инокулята, и условия выращивания (состав среды, начальное значение pH, состав газовой фазы, скорость перемешивания).

Необходимо отметить, что ростовые кривые для разных критериев не идентичны. Дисбаланс между скоростями клеточного размножения (число клеток), синтеза структурных элементов клетки (сухая масса) и увеличения объема и содержания вакуолей (сырая масса) отражает специфику онтогенеза высшего растения.

Для глубинного культивирования растительных клеток применимы способы, разработанные в микробиологии. Различают два вида систем культивирования: открытую и закрытую.

Для закрытой системы характерен периодический режим выращивания. Клеточная масса (инокулят) помещается в определенный объем среды. Система закрыта по всем параметрам, кроме газов, до конца выращивания. Периодически подается свежая питательная среда, а старая удаляется в том же объеме. Клетки остаются в системе в течение всего цикла выращивания.

Открытые (проточные) культуры характеризуются поступлением свежей питательной среды, при котором отбирается не только старая питательная среда, но и часть урожая клеточной массы.

Наиболее изучено и распространено закрытое глубинное культивирование. Для аэрации и перешивания используют различную аппаратуру: роллеры, качалки, магнитные мешалки и т. д. Очень большое значение для роста и биосинтеза клеток in vitro имеют технические характеристики систем культивирования. При масштабировании от небольших по объему культур в колбах до больших многолитровых ферментеров меняются многие параметры культивирования, в частности аэрация и перемешиваемость.