Интернет-журнал "Домашняя лаборатория", 2008 №1

3. Псевдогамия — развитие гаплоидного зародыша после оплодотворения инородной пыльцой без оплодотворения яйцеклетки или же развитие изолированной семяпочки (гиногенез).

В клеточной инженерии чаще применяется первый метод. Впервые гаплоидные растения были получены в 1964 году индийскими исследователями С. Гуха и С. Махешвари при культивировании пыльников дурмана. С тех пор таким методом получены гаплоидные растения более чем у 200 видов, в том числе у пшеницы, ячменя, ржи, риса, картофеля и других культур. Для культуры пыльников используют целые пыльники, стерильно выделенные из бутонов в определенной фазе развития. Их помещают на твердую питательную среду, либо на поверхность жидкой питательной среды. В редких случая культивируют бутоны или соцветия.

Получение гаплоидных растений из изолированных пыльников может идти по двум направлениям: прямая регенерация соматических зародышей и косвенная — через каллусогенез. В первом случае внутри пыльников из отдельных пыльцевых зерен формируются проэмбриональные структуры, которые при определенных условиях культивирования развиваются в эмбриоиды, дающие начало гаплоидным растениям. Эмбриоиды — зародышеподобные структуры. Во втором — пыльца делится, но клетки, возникшие в результате делений, быстро увеличиваются в размерах и, разрывая оболочку пыльцевого зерна, образуют каллус. В результате дальнейшего морфогенеза из этих каллусных клеток регенерируют растения. При этом растения могут иметь разную степень плоидности — ди, поли, анеуплоидные. Последние часто стерильны, но после обработки растений колхицином происходит удвоение числа хромосом, в результате чего можно получить фертильные гомозиготы.

Культура пыльцы представляет собой культивирование микроспор, освобожденных от соматических тканей пыльника, в жидкой среде. Пыльцу от соматической ткани пыльника отделяют несколькими способами:

1. Спонтанное высвобождение (пассивный способ) — пыльники определенным образом обрабатываются, инкубируются на жидкой среде, где лопаются, а пыльца высвобождается и всплывает наверх.

2. Гомогенизация и фильтрация. Пыльники, культивируемые в жидкой среде, разрушают, надрезая скальпелем и осторожно надавливая, затем фильтруют (поры фильтра 50 -100 мкм) и центрифугируют. Осадок промывают и суспендируют в жидкой среде.

3. Разрезание — разрезают стенку пыльника. Этот метод применяется редко, так как трудоемок и длителен.

Пыльцевой эмбриогенез обусловлен функциональной и структурной детерминацией пыльцевого ядра и клеток гаметофита, поэтому в развитии могут принимать участие: — лишь вегетативные клетки, — лишь генеративные клетки, — оба типа клеток, если вегетативные и генеративные клетки сольются, при этом образуется диплоидный эмбриоид. Для пасленовых характерен только эмбриогенез, для злаковых — образование, как каллусов, так и эмбриоидов. Среди гаплоидов много альбиносов (особенно у злаков). Наибольший выход регенерантов-альбиносов в культуре пыльцы, что вызвано, по-видимому, нарушениями развития пыльцы. Причина не установлена, возможно, это результат мутаций в микроспорах при культивировании.

При отдаленной гибридизации некоторых видов установлено явление селективной элиминации хромосом одного из родителей на ранней стадии развития гибридного зародыша. Это явление хорошо изучено у ячменя. При скрещивании диплоидных ячменей Hordeum vulgare (культурный) и Н. bulbosum (многолетний луковичный дикий) на стадии роста зародыша и эндосперма (через 5 дней после оплодотворения) происходит выпад хромосом дикого вида. Возникает гаплоид с набором хромосом Н. vulgare. Через 15 суток после оплодотворения рост гибридного зародыша на материнском растении прекращается, но при культивировании in vitro из таких зародышей развиваются проростки. Частота и количество образовавшихся растений при этом способе очень высоки. Кроме того, растения-альбиносы не образуются. С помощью этого метода были выведены сорта Исток и Одесский-115 — за 4 года вместо 10–12 лет обычной селекции. В Канаде так были получены сорта Минго и Родео.

Элиминация хромосом встречается и у других родов. Если в качестве опылителя использовать дикий ячмень, то можно индуцировать гаплоиды у ржи и пшеницы.

Работы по получению гаплоидов в культуре женского гаметофита начались в 50-е годы. В последнее время интерес к ним возрос. У растений с мужской стерильностью культивирование неоплодотворенных семяпочек является единственной возможностью получения гаплоидов. Женский гаметофит может быть источником получения гаплоидов и у растений с низким морфогенетическим потенциалом каллусной ткани, либо если каллусная ткань регенерирует растения-альбиносы. У некоторых растений, например у ячменя и риса, индукция зеленых растений намного выше при гиногенезе по сравнению с андрогенезом.