Интернет-журнал "Домашняя лаборатория", 2008 №1

При физическом способе слияния протопластов, разработанном Г. Циммерманом с сотрудниками в 1981 году, протопласты помещают в камеру с неоднородным электрополем. На электродах образуются агрегаты из 2–3 протопластов, либо цепочки из 5–6 протопластов между электродами. Дополнительный единичный импульс постоянного тока приводит к образованию пор в сильно сжатых мембранах, происходит перетекание цитоплазмы, так как переменный ток удерживает протопласты вместе некоторое время, и протопласты в таких агрегатах сливаются. Затухающий ток приводит к возвращению сферической формы у слившихся протопластов.

В основе слияния лежит различное действие постоянного и переменного электрического тока на плазмалемму. Постоянное эклектическое поле сжимает мембраны, ведя к их локальному разрушению, а переменное электрополе вызывает латеральную диффузию белков мембраны, образуя свободные от гликопротеидов липидные области, где противоположные мембраны могут установить контакт.

Чаще для индукции слияния протопластов используют методику "ПЭГ — высокие значения pH — высокая концентрация Са₂⁺", которая дает до 50 % слившихся протопластов (pH 9-11, концентрация Са₂

⁺ 100–300 ммоль/л). В присутствии полиэтиленгликоля наблюдается сильная адгезия протопластов, после удаления полиэтиленгликоля и добавления кальция — их слияние. Предполагают, что pH и ионы кальция увеличивают текучесть мембран, что связано с их жидкостномозаичной структурой.

При слиянии протопластов различных растений, например, А и В, могут с равной вероятностью образовываться комбинации АА, ВВ и АВ. Желаемый продукт слияния — АВ, поэтому разрабатываются способы увеличения частоты слияния именно такого типа и избирательного выделения только продукта слияния АВ. Один из таких методов заключается в следующем. Поверхность протопласта обычно несет отрицательный заряд. Путем обработки ее фосфолипидом, несущим положительный заряд, можно временно придать поверхности протопласта положительный заряд. Если теперь протопласты А, имеющие положительный заряд, смешать с необработанными протопластами В, несущими отрицательный заряд, то будут в основном образовываться комбинации АВ в результате притяжения разноименных зарядов.

Разработаны также методы маркирования протопластов того или иного растения с помощью разных флуоресцентных красителей. Если обработать протопласты одного растения флуоресцеинизотиоцианатом (FITC), а протопласты другого растения родаминизотиоцианатом (RITC), то можно, не изменяя активности клеток, пометить их желто-зеленой (FITC) или красной (RITC) флуоресценцией. Гибриды, образовавшиеся путем слияния разных типов клеток, будут иметь оба цвета флюоресценции — желто-зеленый и красный.

Протопласты могут сливаться как попарно, так и в большем количестве. Многоядерные продукты слияния, как правило, разрушаются. Первое сообщение о получении соматических гибридов на уровне растений появилось в 1972 году (Карлсон и коллеги), в нашей стране подобное осуществили в лаборатории Бутенко Р.Г. в 1975 году.

Судьба геномов (ядерного и цитоплазматического) после слияния протопластов может быть различной:

1. Ядерные генетические детерминанты наследуются как дву-, так и однородительски. В последнем случае ядра не сливаются и впоследствии сегрегируют в процессе клеточных делений.

2. Внеядерные генетические детерминанты наследуются двуродительски. При этом в межвидовых комбинациях прослеживается тенденция к соматическому выщеплению и элиминации одного из родительских цитоплазматических геномов.

3. Возникновение гибридных клеток и растений в результате слияния более чем двух родительских клеток.

Таким образом, слияние протопластов приводит либо к образованию гибрида, либо к образованию цибрида. Соматический гибрид — продукт слияния и цитоплазмы, и ядра обоих протопластов. Цибрид (цитоплазматический гибрид) — растение-регенерант, содержащее цитоплазму обоих родителей и ядро одного из них. Цибриды получают, облучая перед слиянием один из протопластов у-лучами для разрушения ядра. Скрининг таких клеток проводится по генам — маркерам ядерного и цитоплазматических (митохондриального и хлоропластного) геномов. Есть указания на рекомбинацию ДНК митохондрий и хлоропластов в гибридных клетках (Ю.Ю. Глеба, К.М. Сытник, 1984).