Интернет-журнал "Домашняя лаборатория", 2008 №1

Культивирование проводят во впадине часового стекла на поверхности сгустка, состоящего из плазмы цыпленка и эмбрионального экстракта кур. Часовое стекло помещают в чашку Петри и закрывают сверху влажной ватой или фильтровальной бумагой для предотвращения высыхания. Культивируют в термостате при 37,5 °C. Существуют модификации этого метода, при которых часовое стекло покрывается крышкой, приклеенной воском и другие. Недостатком метода, ограничивающим применение его в биологических исследованиях, является разжижение сгустка в окрестностях экспланта, который в результате оказывается в жидкости. Кроме того, сложный состав среды затрудняет проведение биохимических исследований.

Эти недостатки устраняются при использовании сгустка агара. Такая техника была предложена Спраттом (рис. 29). Метод основан на получении агарового геля 1–4 % концентрации, основу которого составляют забуференные солевые растворы или питательные среды типа 199 с добавлением эмбриональной сыворотки.

Рис. 29.

Метод часовых стекол с агаровым сгустком

_{(по Вольффу и Хафену, 1952)}

В середине 20-го века Чен обнаружил, что культуры можно выращивать на бумажных плотиках, плавающих на поверхности жидкости в часовом стекле. С целью улучшения техники позднее бумагу обрабатывали силиконом, комбинировали с миллипоровыми фильтрами, а затем перешли на плотики из ацетата вискозы. Этот материал хорошо растворяется в ацетоне, что облегчает подготовку ткани для гистологического анализа.

Метод культивирования на плотиках не лишен недостатков, основной из них — погружение ткани в среду при затоплении плотика. Решение этой проблемы было предложено Троувеллом, который предложил культивировать органы на поверхности металлической сетки (рис. 30). Сетка представляет собой квадрат размерами 25*25 мм с отогнутыми краями, образующими четыре ножки высотой около 4 мм. Скелетные ткани культивируют непосредственно на сетке, тогда как мягкие вначале эксплантируются на бумагу, а затем помещаются на сетку.

Рис. 30. Модифицированный метод Троувелла

_{(по И. Ласнитски}

, 1989)

В 1976 году, для длительного культивирования взрослых тканей человека, таких как эпителий бронхов и молочной железы, пищевод и др. был предложен метод поочередного культивирования в жидкой среде и газовой фазе. Для этого экспланты прикрепляются ко дну пластикового сосуда и покрываются средой. Сосуды помещают в камеру с определенным газовым составом, а камера помещается на качающуюся платформу.

ГИБРИДИЗАЦИЯ ЖИВОТНЫХ КЛЕТОК

История метода

Предположение о том, что соматические клетки могут сливаться друг с другом, было высказано еще в начале XIX века в связи с открытие многоядерных клеток. В историческом аспекте представляет интерес то обстоятельство, что открытие поликарионов как бы подтверждало ошибочное представление Шлейдена, который считал, что новые клетки зарождаются в виде пузырьков внутри цитоплазматической мембраны родительских клеток. Разделявший эту точку зрения Рудольф Вир хов представил в 1851 г. рисунок многоядерной опухолевой клетки в полной уверенности, что ядра являются эндогенными зачатками новых клеток. Кроме того, открытие поликарионов подлило масла в огонь борьбы с клеточной теорией. Противники ее выдвинули гипотезу, согласно которой организм представляет собой единую тканевую массу с непрерывной цитоплазмой, а существование поликарионов рассматривали как подтверждение этой гипотезы. Со временем восторжествовала клеточная теория, а существование поликарионов отнесли к разряду интересных исключений.

Гибриды соматических клеток были открыты лишь в 60-х годах нашего столетия. В 1960 г. Барский с сотрудниками сообщили о выделении линии гибридных клеток. Гибридные клетки были получены путем смешения двух линий, выделенных ранее из 1 клетки мышиной саркомы. Исходные линии отличались по числу и морфологии хромосом, а также по способности к образованию опухоли при введении их мышам. Гибридные клетки содержали число хромосом, отличное от исходных клеточных линий, а также содержали поверхностные антигены клеток обеих родительских линий. Далее было установлено, что клеточные гибриды можно получить, используя клетки различных видов животных. В качестве агента, индуцирующего слияние, выступал инактивированный вирус HVJ, называемый также вирусом Сендай. С этих пор вирус Сендай стал широко использоваться в экспериментах по слиянию клеток.

При изучении межвидовых гибридных клеток, способных к пролиферации были сделаны два очень важных наблюдения:

— в гибридах могут проявиться оба генома;

— в долгоживущих межвидовых гибридах элиминируются хромосомы одного вида.