Интернет-журнал "Домашняя лаборатория", 2008 №1

Более широкие исследования, охватывающие не только амфибий, но и рыб, а также дрозофил, в 1962 г. были начаты английским биологом Дж. Гордоном. Он первым в опытах с южноафриканскими жабами Xenopus laevis в качестве донора ядер использовал не зародышевые клетки, а уже вполне специализировавшиеся клетки эпителия кишечника плавающего головастика. Ядра яйцеклеток реципиентов он не удалял хирургическим путем, а разрушал ультрафиолетовыми лучами. В большинстве случаев реконструированные яйцеклетки не развивались, но примерно десятая часть их них образовывала эмбрионы. 6,5 % из этих эмбрионов достигали стадии бластулы, 2,5 % — стадии головастика и только 1 % развился в половозрелых особей. Однако появление нескольких взрослых особей в таких условиях могло быть связано с тем, что среди клеток эпителия кишечника развивающегося головастика довольно длительное время присутствуют первичные половые клетки, ядра которых могли быть использованы для пересадки. В последующих работах, как сам автор, так и многие другие исследователи не смогли подтвердить данные этих первых опытов.

Позже Гордон модифицировал эксперимент. Поскольку большинство реконструированных яйцеклеток (с ядром клетки кишечного эпителия) погибают до завершения стадии гаструлы, он попробовал извлечь из них ядра на стадии бластулы и снова пересадить их в новые энуклеированные яйцеклетки (такая процедура называется "серийной пересадкой" в отличие от "первичной пересадки"). Число зародышей с нормальным развитием после этого увеличивалось, и они развивались до более поздних стадий по сравнению с зародышами, полученными в результате первичной пересадки ядер.

Затем Гердон вместе с Ласки (1970) стали культивировать in vitro (вне организма в питательной среде) клетки почки, легкого и кожи взрослых животных и использовать уже эти клетки в качестве доноров ядер. Примерно 25 % первично реконструированных яйцеклеток развивались до стадии бластулы. При серийных пересадках они развивались до стадии плавающего головастика. Таким образом было показано, что клетки трех разных тканей взрослого позвоночного (X. laevis) содержат ядра, которые могут обеспечить развитие по крайней мере до стадии головастика.

В свою очередь Ди Берардино и Хофнер (1983) использовали для трансплантации ядра неделящихся и полностью дифференцированных клеток крови — эритроцитов лягушки Rana pipiens. После серийной пересадки таких ядер 10 % реконструированных яйцеклеток достигали стадии плавающего головастика. Эти эксперименты показали, что некоторые ядра соматических клеток способны сохранять тотипотентность.

Причины, по которым ядра клеток взрослых животных и даже поздних эмбрионов остаются тотипотентными, пока точно не установлены. Решающую роль играет взаимодействие ядра и цитоплазмы. Содержащиеся в цитоплазме животных вещества принимают участие в регулировании экспрессии клеточного генов ядра. Не исключено, что ядра дифференцированных клеток не могут изменить асинхронную репликацию ДНК на синхронную, характерную для ранних стадий эмбриогенеза. В связи с этим вопрос о возможности активации генов в дифференцированных соматических клетках представляет особую важность. Работы М. ди Бернардино и Н. Хоффера показали, что цитоплазма ооцитов амфибий содержит факторы, восстанавливающие тотипотентность ядер дифференцированных соматических клеток. Эти факторы реактивируют репрессированные участки генома.

В 1985 г. была описана технология клонирования костных рыб, разработанная советскими учеными Л.А. Слепцовой, Н.В. Дабагян и К.Г.Газарян. Зародыши на стадии бластулы отделяли от желтка. Ядра клеток зародышей впрыскивали в цитоплазму неоплодотворенных икринок, которые начинали дробиться и развивались в личинки. Эти эксперименты показали, что потеря ядром тотипотентности в процессе онтогенеза связана не с утерей генов, а их репрессией. При культивировании соматических клеток in vitro частота тотипотентности ядер увеличивается. Генетический механизм стабильной репрессии генома дифференцированных клеток не выяснен, способы восстановления тотипотентности не разработаны, поэтому в основном ведется клонирование путем трансплантации ядер эмбриональных клеток.

Пересадки ядер у млекопитающих начались позднее, в 80-х годах. Это было связано с техническими трудностями, так как зигота млекопитающих имеет небольшие размеры. Например, диаметр зиготы мыши приблизительно 60 мкм, а диаметр оплодотворенной яйцеклетки лягушки около 1200 мкм, т. е. в 20 раз больше. Зигота коровы несколько крупнее, чем зигота мыши, диаметр ее составляет 160 мкм, но пронуклеусы скрыты яичным желтком, поэтому перед микроманипуляциями необходима специальная обработка зигот.