Интернет-журнал "Домашняя лаборатория", 2008 №1

Стабильно введенный ген должен передаваться потомству при семенном размножении, поэтому важно определить этот параметр на практике. Уровень транскрипции введенного гена оценивается обычно с помощью традиционного Northern-блотинга или недавно предложенных количественных версий RT PCR (на мРНК с помощью обратной транскриптазы синтезируется комплементарная цепь ДНК, которая и размножается в полимеразной цепной реакции). В ряде случаев экспрессию гена проще и надежнее контролировать по конечному белковому продукту или тому эффекту, который этот белок вызывает.

Однако необходимо использование разных методов для доказательства истинной трансгенности данного растения, чтобы исключить "псевдотрансгенные" черты, вызванные сомаклональной (эпигенетической) изменчивостью или неполной элиминацией агробактерий

Для изучения молекулярной конституции генома трансгенных организмов можно использовать полиморфизм длины рестрикционных фрагментов. Метод основан на том, что гомологичные последовательности ДНК гибридов и их родителей при разрезании рестриктазами могут попасть во фрагменты разной длины. В качестве маркеров родительских геномов можно использовать и часто повторяющиеся последовательности ДНК. Повторяющиеся последовательности составляют значительную часть генома типичного растения. Большая часть последовательностей повторяется до 1000 раз на геном. У многих растений выявлены еще более частые повторы (100000 — 1000000 копий на геном), которые составляют до 20 % генома. Они имеют отличный от остальной клеточной ДНК "Г-Ц" состав и в градиенте хлористого цезия выявляются в виде сателлитного компонента. В геномах даже очень близких видов амплифицируются разные типы повторов, поэтому они становятся своеобразными "отпечатками пальцев" близкородственных геномов. Высокотандемные последовательности ДНК относительно легко клонируются, так как после расщепления рестриктазой, имеющей сайт узнавания в повторе, эти последовательности легко выявляются в виде полос при электрофоретическом разделении фрагментов и могут быть элюированы из геля в чистом виде. Их можно использовать в качестве зондов. Использование высокоповторяющихся последовательностей в качестве молекулярных зондов позволяет вести одновременный скрининг большого количества образцов грубоочищенной ДНК регенерировавших после слияния протопластов растений или каллусов методом дот-гибридизации.

Как другой биохимический маркер при анализе соматических гибридов может использоваться рибулозо-1,5-бифосфат карбоксилаза/оксигеназа. Причины: необычайно высокое содержание его в листьях (до 50 % растворимого белка), хорошо разработанные методы выделения и анализа, а также то, что составляющие этот белок субъединицы кодируются как ядерным (мол. масса 14 кД), так и хлоропластным (большая субъединица, мол. масса 55 кД) геномами.

Характеристика Ti- и Ri-плазмид

A. tumefaciens вызывает образование опухолей стебля двудольных растений — так называемых корончатых галлов. Бактерии прикрепляются к клетками растения в местах повреждений. Сайтами связывания на поверхности бактерий, видимо, являются молекулы β-глюкана и О-антигенной цепи липополисахарида внешней мембраны.

Бактерии связываются с рецепторами высшего растения, состоящими из белка и пектина; лектины в данном случае не имеют значения. Бактериальные сайты связывания и рецепторы растений являются констуитивными, т. е. оба партнера обладают ими еще до момента взаимодействия. Первый шаг взаимодействия с растением — узнавание — следует рассматривать как специфическую адгезию растений. Как только бактерии прикрепились к поверхности клеток растения, они начинают образовывать целлюлозные фибриллы. Эти фибриллы можно увидеть в сканирующем электронном микроскопе уже через 90 минут после добавления бактерий к суспензии культуры клеток ткани моркови. К 10 часам инкубации фибриллы формируют сеть, покрывающую поверхность растительных клеток. Фибриллы служат более прочному закреплению бактерий на поверхности хозяина. За целлюлозные фибриллы могут зацепиться свободно плавающие клетки бактерий. Фиксируя их у поверхности растения, фибриллы увеличивают множественность заражения. В результате размножения образуются скопления бактерий на поверхности растения.

Клеточная стенка растения повреждается вследствие выделения бактериями пектолитических ферментов, что обеспечивает плотный контакт бактерий с плазмалеммой растительной клетки. Этот контакт необходим для передачи ДНК от бактерий в растительную клетку. Передача ДНК происходит без нарушения целостности мембраны растительной клетки, но требует определенного её состояния — компетентности.