Интернет-журнал "Домашняя лаборатория", 2008 №1

Пробирки с растениями картофеля, стерильный пинцет, скальпель, кисточка, стаканчик с этанолом, чашка Петри, кафельная плитка, спиртовка, спички, пробирки с питательной средой МС.

Для замедления роста растений из черенков ТУР (ретардант, применяемый в сельском хозяйстве против полегания стеблей растений — хлорхолинхлорид, ССС) в концентрации 0.4–0.5 мл/л добавляют в среду МС, при этом промежуток между двумя последующими черенкованиями увеличивается с 1 до 4 месяцев, а высота со сближенными междоузлиями не превышает 3–4 см. Растения приобретают темно-зеленую окраску.

Одним из способов сохранения и поддержания коллекции in vitro является клубнеобразование в пробирках. На процесс образования клубней in vitro оказывает влияние фотопериод, температура, ростовые вещества, содержание сахарозы в питательной среде.

Ход работы

Черенки переносят на модицифированную питательную среду МС для образования клубней картофеля, ее компоненты:

Макроэлементы по прописи МС

Микроэлементы по прописи МС

Источники железа

Витамины по прописи МС + аденин — 0.25 мг/л

Источник углерода: сахароза — 70 г/л

Агар-агар — 7 г/л

Гормоны: ИУК — 1 мг/л

pH готовой среды — 5.6–5.8.

Культивирование черенков проводится под люминесцентными лампами при 10 часовом фотопериоде, освещенности 3.5–4 тыс. люкс, влажности 70 %. После трехнедельного выдерживания на 10-часовом фотопериоде растения переносят на 2 суток в темноту, а затем на 16 часовой период и оставляют в этих условиях до завершения клубнеобразования. После отмирания растений и достижения микроклубнями размера 0.7–1.4 см их извлекают из пробирок (в стерильных условиях) и хранят в пробирках, закрытых ватными пробками, в холодильнике, при температуре +2 — +4 °C.

КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ЖИВОТНЫХ КЛЕТОК

Культивирование фибробластов человека

Культуральная посуда и оборудование

Пипетки мерные от 1 до 10 мл, пипетки Пастера, пенициллиновые флаконы, пробирки Лейтона, мерные флаконы от среды разных объемов, пробки резиновые № 10, 12.5, 14.5, 24; стекла покровные для микроскопии, предварительно нарезанные для помещения их в пенициллиновые флаконы, пинцеты глазные анатомические и хирургические, зажим Кохера, бритва безопасная, препаровальная игла из нержавеющей стали, резиновая груша для работы с пипетками (с надетой резиновой трубкой), инвертированный микроскоп, ламинар-окс, термостат.

Питательная среда

Фибробласты успешно культивируют на разных средах, но рекомендуется использовать следующий состав питательной среды — среда Игла — 90–85 %, сыворотка крупного рогатого скота — 5-10 %, пуповинная сыворотка человека (фетальная сыворотка) — 5 %, глютамин — 150 мг на 500 мл готовой среды. Готовую среду и её компоненты рекомендуется хранить при 4 °C. При культивировании эксплантов рекомендуется использовать антибиотики (40–60 мкг канамицина на 1 литр среды).

Ход работы

1. Взятие биопсии. Фибробласты можно получать из многих тканей и органов. Проще всего — фибробласты дермального слоя кожи. Наиболее удобно брать биопсию со внутренней стороны предплечья левой руки (нижняя треть). Кожу дезинфицируют 70 % этиловым спиртом. Не рекомендуется употреблять другие дезинфицирующие растворы, так как в случае проникновения в биопат они могут оказать токсическое действие. После дезинфекции кожу захватывают глазным хирургическим пинцетом, оттягивают и отрезают кусочек кожи непосредственно под браншами пинцета. Не следует стремиться взять глубокие слои кожи. При правильно взятой биопсии, захватывающей эпидермис и сосочковый слой кожи, кровотечение минимально. Отсечение лучше проводить лезвием безопасной бритвы, простерилизованной (как и пинцет) путем погружения в этиловый спирт с последующим поджиганием. Отсеченный кусочек погружается в заранее приготовленный пенициллиновый флакон со средой. На рану накладывают бактерицидный пластырь. Фрагмент кожи может храниться в питательной среде при 4 °C в течение 3–4 суток без утраты фибробластами способности к росту.