Интернет-журнал "Домашняя лаборатория", 2008 №1

В растении любая клетка окружена другими клетками, но ее положение меняется в ходе онтогенеза в результате деления как этой, так и окружающих клеток. От положения клетки в растении зависит степень и тип дифференциации этой клетки. Следовательно, физическое окружение клетки влияет на ее метаболизм. Каким образом? Регуляция синтеза вторичных метаболитов находится как под генетическим, так и под эпигенетическим (внеядерным) контролем, то есть любые изменения в цитоплазме могут привести к количественным и качественным изменениям в образовании вторичных метаболитов. В свою очередь, цитоплазма представляет собой динамическую систему, находящуюся под влиянием окружающей среды.

Из внешних условий на метаболизм существенное влияние оказывают 2 важных фактора: концентрация кислорода и углекислого газа, а также уровень освещения. Свет играет роль и в процессе фотосинтеза, и в таких физиологических процессах, как деление клеток, ориентация микрофибрилл, активация ферментов. Интенсивность и длина световой волны определяется положением клетки в массе других клеток, то есть зависят от степени организованности ткани. В организованной структуре существуют центробежные градиенты концентрации О₂ и СО₂, которые играют исключительно важную роль в процессе дифференциации.

Таким образом, вторичный метаболизм в крупных агрегатах клеток с небольшим отношением площади к объему (S/V) отличается от такового изолированных клеток и мелких групп клеток в результате действия градиентов концентрации газов. Аналогично действуют градиенты регуляторов роста, питательных веществ, механического давления. Условия окружения у диспергированных клеток и клеток в виде агрегатов различны, поэтому пути метаболизма у них также различаются.

3. Регулировать выход вторичных метаболитов можно также, изменяя химический состав окружающей среды.

Изменение состава среды для каллусной и суспензионной культуры сопровождается определенными физическим манипуляциями с клетками, что может привести к повреждению или загрязнению культур. Эти трудности можно преодолеть, используя циркуляцию больших объемов питательной среды вокруг физически неподвижных клеток, что позволяет осуществлять последовательные химические воздействия.

4. В некоторых случаях возникают проблемы с выделением идиолитов.

При использовании иммобилизованных клеток относительно легко осуществляется обработка их химическим веществами, индуцирующими высвобождение требуемых продуктов. Это также снижает ингибирование по типу обратной связи, которое ограничивает синтез веществ вследствие накопления их внутри клетки. Культивируемые клетки некоторых растений, например, Capsicum frutescens выделяют вторичные метаболиты в окружающую среду, а система иммобилизованных клеток позволяет отбирать продукты без повреждения культур. Таким образом, иммобилизация клеток способствует легкой изоляции идиолитов.

Системы культивирования иммобилизованных клеток

Существует 2 типа систем культивирования иммобилизованных клеток:

1. Система культуры с плоской основой, клетки выращиваются в горизонтально расположенном сосуде.

2. Система колоночной культуры, где клетки выращиваются в вертикальном сосуде.

В обеих системах жидкая среда циркулирует вокруг физически неподвижных клеток.

Система культуры с плоской основой (рис. 13)

Рис. 13.

Система культуры с плоской основой

Питательная среда капает под действием силы тяжести из цилиндрического сосуда объемом 70 мл (1) в стеклянный сосуд для культивирования (3) объемом 350 мл, где находятся клетки (40–50 г сырой массы), посаженные на субстрат — подстилку из нетоксичной полипропиленовой ткани. Питательная среда проникает сквозь ткань под действием капиллярных сил, снабжая клетки. После этого использованная питательная среда откачивается из сосуда для культивирования с помощью перистальтического насоса (2) обратно в резервуар и используется повторно.

Исследования, проведенные с этой системой, показали, что клетки Solanum niger, культивируемые на плоской основе (среда Мурасиге-Скуга с добавлением 2,4-Д и кинетина) способны потреблять питательные вещества и быстро реагируют на недостаток ортофосфата. Увеличение сырой массы идет гораздо медленнее, чем в суспензионных культурах. Количество жизнеспособных клеток такое же и достигает 70–80 %. Количество алкалоидов через 7 суток культивирования достигает 12 мг/г сухой массы, в суспензии же через 18 дней культивирования оно составляет 10 мг/г сухой массы. В местах, где питательная среда капает прямо на клетки, через 3–4 дня культивируемая ткань становится темной и отличается от остальной, которая у S. niger окрашена в светло-бежевый цвет. Клетки в зонах капания часто бывают более компактны, содержат больше алкалоидов. Если клетки изолировать из зон капания и поместить в чашки Петри с агаром, содержание алкалоидов падает, при возвращении в прежние условия культивирования вновь аккумулируются высокие количества метаболитов.