Интернет-журнал "Домашняя лаборатория", 2008 №1

В результате этих манипуляций вы имеете абсолютно стерильную поверхность плитки со стерильными инструментами на ней. Постарайтесь контролировать свои движения и доставать экспланты, открывать пробирки не над плиткой непосредственно, а в зоне между плиткой и горящей спиртовкой, то есть за плиткой. На стерильной плитке вы можете резать эксплант, класть его пинцетом на кончик скальпеля для последующего переноса на питательную среду и она должна оставаться стерильной. Старайтесь не трясти над ней рукавами халата. Использованные инструменты снова погружаете в спирт. Перед каждым новым эксплатном все операции по стерилизации, начиная с обжигания поверхности плитки, повторяются. Помните, что скальпель вы держите указательным и большим пальцем (он лежит на указательном и среднем, зажатый большим пальцем, а крышки с пробирок снимаете мизинцем, предварительно пронеся горлышко пробирки через пламя спиртовки.

Стерилизация растительного экспланта

Стерильная культура — культура, свободная от эпифитных и ризосферных микроорганизмов.

Работающий должен вымыть руки с мылом и протереть их спиртом, надеть стерильный халат, завязать волосы стерильной косынкой.

Перед стерилизацией объекта его тщательно моют теплой водой с мылом, промывают дистиллированной водой, очищают от излишних тканей, снимают кожуру у корнеплодов и корней, кору у побегов, поверхностные листья у верхушек побегов, промывают дистиллированной водой и помещают на несколько секунд в 70 % спирт (семена на 1–2 минуты). После этого сегменты корней, побегов, стеблей, клубней или семена переносят в стерилизующий раствор.

Вид стерилизующего агента, его концентрация и время действия, зависящие от особенностей тканей исходных растений, необходимо подобрать таким образом, чтобы убить микроорганизмы и не повредить ткани экспланта. Для поверхностной стерилизации растительных объектов применяют следующие средства стерилизации: сулему (двуххлористая ртуть) (0.1 %), хлорамин (2-10 %), гипохлорит кальция (7-10 % Са(ClO)₂) или натрия (NaOCl), перекись водорода (13–18 %) и др. Хлорамин можно купить в аптеке. Для стерилизации можно использовать также хлорсодержащие растворы отбеливателей из хозяйственных магазинов, например, средство "Белизна". Свежие растворы отбеливателей при стерилизации нежных эксплантов, таких как молодые листочки, нужно разводить в 2 или даже в 3 раза. Эффективность стерилизации возрастает при добавлении нескольких капель твина-80 и твина-20 на литр стерилизующего раствора.

Продолжительность стерилизации меристем сулемой — 5 минут, семян — 15–20 минут, пергидролем соответственно 15 и 30 минут.

После стерилизации материал переносят в стерильную дистиллированную воду, выдерживают 10 минут, затем меняют воду ещё два раза, выдерживая в каждой порции по 15–20 минут. В стерильных чашках Петри или на стерильных листах бумаги, или на обожженной кафельной плитке обрезают стерильным скальпелем концы сегментов исходного материала, где клетки могут быть повреждены, и из средних зон нарезают кусочки тканей, которые высаживают на инициальную среду для образования каллусов. При стерилизации отрезков стебля или верхушечных почек в растворах сулемы или гипохлорита рекомендуется парафинировать срезы, чтобы стерилизатор не проник в сосуды, что может привести к интоксикации ткани.

Ход работы

Простерилизовать инструменты, посуду и питательные среды, необходимые для проведения работ по выращиванию стерильных проростков и выращивания каллусных тканей.

1. Завернуть в плотную бумагу и простерилизовать сухим жаром в сушильном шкафу стеклянную посуду — колбы, чашки Петри.

2. Подвергнуть предварительной стерилизации в сушильном шкафу скальпели и пинцеты. Перед помещением в сушильный шкаф завернуть инструменты в плотную бумагу.

3. Простерилизовать в автоклаве дистиллированную воду в колбе. Для получения стерильной воды налейте в колбу 1/3 часть объема дистиллированной воды, закройте ватной пробкой, а сверху плотной бумагой или целлофаном, можно обернуть горлышко фольгой. Автоклавировать 30 минут при 1 атмосфере.

4. Простерилизовать в автоклаве в течение 20 мин при давлении 1 атм. пробирки с питательной средой, закрытые фольгой или ватными пробками, обернутыми плотной бумагой или целлофаном.

Питательные среды для растительных биотехнологических объектов

Успех в культивировании объектов зависит от правильного выбора питательной среды и тщательности её приготовления. В состав питательных сред входят макро- и микроэлементы (N, Р, К, Са, S, Mg, Fe, В, Zn, Сu, Со, Mn, J, Мо); витамины B₁, В₆, В₁₂, РР и другие; углеводы (сахароза, глюкоза, маннит); фитогормоны (чаще всего цитокинины и ауксины в определенном соотношении). Ауксины вызывают клеточную дедифференцировку, цитокинины индуцируют деление дедифференцированных клеток и необходимы для получения каллусных тканей.

На средах без гормонов растут "привыкшие" и опухолевые ткани.

Для получения стеблевого морфогенеза снижают содержание ауксинов.