Кровь: река жизни. От древних легенд до научных открытий

Хроматографию изобрел в 1906 году русский ботаник Михаил Цвет. Он хотел разделить различные пигменты из листьев растений. Эти пигменты были настолько схожи по химическому составу, что обычные методы разделения были не эффективны. Тогда Цвет использовал совершенно новый способ.

Он приготовил из смеси пигментов раствор и вылил его в колонку, наполненную измельченным известняком. Пигменты прикрепились к поверхности крошечных частиц в верхнем слое известняка, а жидкость, в которой они были растворены, прошла по колонке вниз и вышла из нее. Первоначально окрашенный раствор вышел бесцветным, а в верхней части колонки осталась цветная полоска пигмента.

Затем Цвет пропустил через колонку другую жидкость — петролейный эфир. Эфир медленно вымывал пигмент из известняка. Причем каждый пигмент вымывался с различной скоростью. Те, которые связывались с известняком слабо (или очень хорошо растворялись в петролейном эфире), вымывались довольно быстро; те, которые связывались более прочно (или плохо растворялись в эфире), вымывались медленнее. Со временем исходная смесь пигментов была разделена на несколько цветных полос, в каждой из которых находился отдельный пигмент. Эти полосы можно было полностью вымыть из колонки и исследовать по отдельности.

Цвет назвал свой метод хроматографией, от греческих слов, означающих «цветное письмо», потому что состав смеси вырисовывался в виде цветных поперечных полос, располагающихся вдоль колонки. Естественно, этот метод применим и к бесцветным соединениям.

Много лет метод Цвета не получал признания, потому что первый доклад ученого был напечатан в довольно плохом немецком ботаническом журнале, а последующие доклады Цвета были на русском языке. Он был всего-навсего русским ботаником, и немецкие биохимики, правящие в науке в те времена, не обращали на него внимания. Однако в 1931 году немецкий биохимик Рихард Вильштеттер наткнулся на описание этого метода и начал его использовать. После этого хроматография получила широкое распространение.

Кроме известняка, в качестве наполнителя колонки использовались и другие измельченные вещества: окись алюминия, крахмал, позже стали применять ионообменные смолы. Смолы представляют собой ломкие вещества янтарного цвета, состоящие из крупных молекул, в состав которых входит бесчисленное количество групп атомов. Эти атомы в результате химических реакций способны в одних условиях соединиться с определенными видами молекул и, наоборот, отсоединяться от них в других условиях. Смолы разного состава обладают большим разнообразием свойств и поэтому подходят для многих видов исследований. Некоторые даже могут опреснять воду. Морскую воду пропускают через колонку со смолой и получают питьевую воду.

Большой шаг вперед был сделан в 1944 году, когда группа британских биохимиков из Кембриджского университета показала, что разделение смеси веществ на составляющие компоненты можно производить на фильтровальной бумаге. Вместо того чтобы пропускать растворитель через колонку, заполненную измельченным веществом, они смачивали им фильтровальную бумагу. Растворитель поднимался (или спускался) по бумаге, проходил то место, куда наносили каплю исследуемой смеси, и распространялся по бумаге дальше, увлекая за собой компоненты смеси, которые двигались с различной скоростью. В результате одно пятно смеси превращалось в несколько, каждое из которых соответствовало отдельному компоненту. Такой способ получил название бумажной хроматографии и сегодня является одним из часто применяемых методов из методического арсенала биохимиков. Почти каждое исследование завершается разделением смеси или очисткой отдельного вещества при помощи бумажной хроматографии.

Вернемся теперь к доктору Ингрэму и пептидной смеси, полученной при расщеплении гемоглобина.

Мы остановились на полученных с помощью электрофореза на бумаге пятнах, в каждом из которых находилось несколько пептидов. Затем он провел бумажную хроматографию пятен: смочил бумагу раствором, разделил их на «подпятна».

Когда все было сделано, на фильтровальной бумаге образовалось двадцать восемь отдельных пятен. Ингрэм пронумеровал каждое и проделал то же самое, только на этот раз с гемоглобином S, а не с гемоглобином А. При разделении фрагментов гемоглобина S у него также получилось двадцать восемь пятен.

Можно сказать, что он взял у каждой молекулы «отпечатки» и теперь ему оставалось их сравнить. Оказалось, что они у молекул гемоглобина А и S были одинаковы, за исключением одного пятна. Пятно под номером 4 в образце гемоглобина S отчетливо переместилось влево по сравнению с аналогичным пятном гемоглобина А.

Доктор Ингрэм неоднократно повторил эксперимент с обоими видами гемоглобина, каждый раз вырезая пятно номер 4, вымывал пептид из бумаги, пока не собралось достаточное количество материала. Конечно, это занятие было утомительным, но совершенно необходимым.