Еще одной жертвой кровавого правления Ивана Грозного, в котором патологическая жестокость сочеталась с мрачной, но искренней религиозностью, стал преподобномученик Корнилий Псково–Печерский (1501—1570). При посещении царем Псково–Печерского монастыря игумен Корнилий вышел к нему навстречу, держа в руках крест. Разгневанный ложным наветом, Грозный в припадке ярости собственноручно отсек игумену голову, однако, тотчас раскаявшись, взял его тело и на руках понес в монастырь: с тех пор дорога от ворот до Успенского собора монастыря называется «кровавым путем». Дабы загладить свою вину, царь сделал щедрые пожертвования Псково–Печерскому монастырю, а имя преподобного Корнилия записал в синодик.
Грозного царя сменил на русском престоле Федор Иоаннович (1557—1598), отличавшийся слабостью здоровья, кротостью и набожностью. В его правление произошло историческое для Русской Церкви событие — учреждение патриаршества. В отличие от автокефалии, которая была провозглашена без согласия Константинопольского патриарха, Московское патриаршество учреждалось с соблюдением всех необходимых канонических условий. В 1586 году Москву посетил Антиохийский патриарх Иоаким V, а в 1588–м — Константинопольский патриарх Иеремия II. Оба иерарха приезжали в Москву за милостыней, которую получили из щедрых рук царя. Иеремии II было в Москве сделано предложение перенести Константинопольский патриарший престол во Владимир, однако от этого предложения он отказался, справедливо полагая, что патриарший престол должен находиться там же, где и царский. Тогда к патриарху обратились с предложением «поставить на патриаршество Владимирское и Московское» митрополита Московского Иова. Патриарх сначала не соглашался, ссылаясь на отсутствие достаточных полномочий, но затем дал свое согласие.
Поставление Иова на патриаршество было совершено при личном участии патриарха Иеремии, и учреждение патриаршества было закреплено специальной соборной грамотой. В 1590 году церковный Собор в Константинополе утвердил русское патриаршество и определил патриарху Московскому пятое место в диптихах после Константинопольского, Александрийского, Антиохийского и Иерусалимского. Константинопольский Собор 1593 года, в котором участвовали четыре восточных патриарха, подтвердил учреждение патриаршества в Москве, о чем в Москву была направлена грамота, подписанная 42 архиереями.
Во время патриаршества святого Иова пресеклась правящая династия Рюриковичей: в 1591 году в Угличе был убит царевич Димитрий, а в 1598–м умер царь Федор Иоаннович. Трон перешел к боярину Борису Годунову, однако в 1605 году был захвачен самозванцем, выдававшим себя за чудесно спасшегося царевича Димитрия. Самозванец сместил с престола престарелого патриарха Иова, на место которого был избран рязанский архиепископ Игнатий. После того как Лжедимитрий I был в 1606 году смещен, Игнатия лишили сана, признав его действия в период смуты преступными. Царем стал боярин Василий Шуйский, а на патриаршество был избран казанский архиепископ Гермоген.
Смута, однако, продолжалась, в Тушине объявился еще один самозванец, Лжедимитрий II, а в 1609 году в Россию вошли войска польского короля Сигизмунда III (1566—1632). В 1610 году Василий Шуйский был свергнут, и власть формально перешла к Боярской думе, однако вскоре оказалась в руках польского королевича Владислава. Патриарх фактически возглавил сопротивление полякам и благословил создание в 1611 году народного ополчения. За это он был заточен поляками в Чудов монастырь, а на его место был поставлен ранее лишенный сана Игнатий. Из заточения патриарх Гермоген продолжал рассылать послания, призывая народ встать на защиту Православия. В феврале 1612 года патриарх, уморенный голодом, скончался в темнице, а в октябре того же года народное ополчение под предводительством Минина и Пожарского освободило Москву. Игнатий бежал в Речь Посполитую, принял униатство и стал настоятелем Виленского Свято–Троицкого монастыря. Исповеднический подвиг патриарха Гермогена вошел в историю Русской Церкви, и он был канонизирован в 1913 году, во время празднования трехсотлетия дома Романовых.
Когда в 1613 году на царство был избран Михаил Федорович Романов, митрополитом Московским и «нареченным патриархом» стал его отец, боярин Федор Романов, в 1600 году, при Борисе Годунове, насильственно постриженный в монахи с именем Филарет. Будучи отцом и духовным наставником царя, Филарет активно участвовал в управлении государством, именовался «великим государем» (ранее патриархи употребляли только традиционный церковный титул «великий господин»), создал собственный двор по образцу царского и получил в прямое управление Патриаршую область, в которую вошло более 40 городов. При Филарете патриаршество превратилось в могущественный центр власти, по сути параллельный царскому, что в значительной степени предопределило конфликт между царем и патриархом в середине XVII и упразднение патриаршества в начале XVIII века.