Простое начало. Как четыре закона физики формируют живой мир

Работая в качестве бактериальной иммунной системы, CRISPR/Cas использует комплементарность ДНК и РНК (см. главу 3), а также нуклеазную активность белков (способность расщеплять ДНК)¹⁸. Белки Cas1 и Cas2 разрезают обнаруженные ими в клетке чужеродные, скорее всего вирусные, молекулы ДНК и вставляют фрагменты в клеточный геном – в самое начало CRISPR-кассеты, добавляя заодно и новый повтор. Таким образом получается, что повторы разграничивают отдельные фрагменты (спейсеры) в библиотеке знакомых клетке вирусных геномов. Далее клетки совершают, казалось бы, безрассудный поступок и транскрибируют цепочку повторов и спейсеров в молекулу pre-crРНК (предшественницу CRISPR-РНК). Как вы помните из главы 3, транскрипция обычно служит первым шагом к синтезу белков, а синтез вирусных белков для клетки может быть опасен. РНК повторов, однако, частично комплементарна tracrРНК

(trans-activating crRNA), которая считывается с участка генома поблизости от CRISPR-локуса. Каждый повтор в pre-crРНК спаривается с tracrРНК

, после чего с каждым из этих РНК-дуплексов связывается белок Cas9, а особый фермент нарезает pre-crРНК на отдельные crРНК, состоящие из одного спейсера и части повтора. Так образуется набор связанных с Cas9 и скрученных в двойную спираль crРНК

/tracrРНК-гибридов со свободно висящим сегментом вирусного происхождения (см. среднюю часть рисунка).

Комплекс РНК-Cas9 бродит по клетке благодаря броуновскому движению. Если среди встречных молекул ДНК ему попадается та, что содержит специфическую короткую и довольно распространенную последовательность нуклеотидов (PAM, protospacer adjacent motif

), он прикрепляется к ней в этом самом месте (кстати, та же последовательность помогает Cas1 и Cas2 определять, где разрезать чужеродную ДНК для включения в CRISPR-кассету). Cas9 расшатывает связи между нитями ДНК, по сути расплавляя двойную спираль на небольшом участке. Если однонитевая РНК, которую переносит Cas9, комплементарна одной из распаренных нитей ДНК – а это возможно только с ДНК того же вируса, по фрагменту которого сформирована crРНК, – образуется ДНК-РНК-гибрид. Эта необычная, но стабильная двойная спираль занимает в Cas9 бороздку, «выстланную» положительными электрическими зарядами, которые удерживают сильно электроотрицательные ДНК и РНК на месте (см. нижнюю часть рисунка; ДНК обозначена черным).

Cas9 содержит два нуклеазных домена, способных расщеплять ДНК. Когда белок захватывает ДНК-РНК-спираль, домены меняют ориентацию так, чтобы каждый из них контактировал с одной из нитей вирусной ДНК – той, что соединилась с РНК, и той, что осталась в одиночестве. На рисунке ниже я показал самое радикальное изменение формы, где один из доменов, черная спираль, поворачивается почти на 180 градусов. Cas9 вносит в каждую нить по разрезу, и эта часть вирусного генома теряет функциональность. Белок удаляется: его дело сделано¹⁹.

Существуют разные системы CRISPR с разными наборами ассоциированных с ними белков, но я не буду углубляться в это²⁰. Базовый механизм сходен у всех, и потому я сосредоточусь на относительно простом и изящном белке Cas9, который эксплуатируют в большинстве биотехнологических проектов.

CRISPR/Cas9 как бактериальная иммунная система весьма впечатляет, ведь в ней память совмещается с защитой. На своем глубинном уровне она показывает, что миллиарды лет назад Природа решила одну из главных задач генной инженерии: научилась находить целевую последовательность нуклеотидов среди миллионов прочих и вносить в нее изменения. Поиск здесь подразумевает пользование библиотекой вирусных ДНК, а изменение – простое уничтожение расщеплением. Некоторые ученые, однако, догадались, что природные разработки можно подправить, чтобы расширить область их применения и даже сделать их созидательными.