В августе-сентябре 1942 г. Анохин проводит испытания планера А-40, предназначенного для десантирования лёгкого танка Т-60 методом буксировки за самолётом. С этой целью к танку крепились крылья и хвостовое оперение. Было выполнено несколько подлётов и один полёт на буксире за самолётом ТБ-3, который состоялся 2 сентября 1942 г. Однако мощности моторов ТБ-3 для длительной буксировки (даже со снятой башней танка) оказалось недостаточно, и лётчик П.А.Еремеев произвел вынужденную отцепку А-40. Анохин приземлился на аэродроме в Быково (взлетали с аэродрома ЛИИ, расположенного примерно в пяти километрах от этого места). Испытания прекратились.
Параллельно с испытательной работой Сергей Николаевич участвует в боевых действиях. Будучи командиром лётного отряда 19-й гвардейской воздушно-десантной бригады на Калининском фронте, в течение 1942-1943 гг. он совершил несколько вылетов в тыл врага к партизанам на планерах: доставлял боеприпасы, медикаменты, продукты.
Летчики Сергей Анохин и Юрий Желютов в апреле 1943 г. выполнили ставший единственным за весь период Великой Отечественный войны взлёт планера с партизанского аэродрома. Обычно планеры после выполнения задания уничтожались, а пилоты возвращались обратно на самолётах. Но в тот раз правило нарушили, потому что тяжело раненых партизан необходимо было срочно доставить в госпиталь. Ограниченные размеры аэродрома и предельная загрузка планера не помешали Сергею Николаевичу мастерски произвести взлёт на коротком тросе за самолётом СБ. Жизнь людей была спасена, и за этот подвиг Анохин получил свою первую боевую награду – орден Красного Знамени.
В июне 1943 г. Анохина по личному распоряжению члена Государственного Комитета Обороны Г.М.Маленкова откомандировали в Лётно-исследовательский институт для проведения испытаний самолёта «302» – одного из первых истребителей-перехватчиков с ЖРД. К сожалению, из-за того, что двигатель не был доведен, самолёт испытывали только в планерном варианте. В сентябре 1943 г. Сергей Николаевич перешел в ЛИИ на постоянную работу.
При проведении 5 октября 1943 г. испытаний самолета, снабженного турбокомпрессором для повышения высотности, в воздухе загорелся мотор. Сергей Николаевич посадил горящую машину на свой аэродром и уже на пробеге покинул кабину. Пожар был ликвидирован, опытный самолёт спасён.
Анохин выполняет 15 мая 1944 г. первый полёт самолёта Як-7Б с прямоточным воздушно-реактивным двигателем ДМ-4с и проводит его испытания.
Одновременно Сергей Николаевич участвует в лётных исследованиях по влиянию перегрузок на организм и работоспособность лётчика в полёте. Он выполняет ряд испытательных полётов на высотном самолёте-перехватчике Як-3ПД на высотах более 13000 метров, сложность которых заключалась в отсутствии герметичной кабины на этой машине.
В марте 1944 г. Анохину присвоена квалификация «лётчик-испытатель 3-го класса», в июле 1945 г. – «лётчик- испытатель 2-го класса».
Контрольные испытания истребителя Як-3 на прочность Анохин выполнял 17 мая 1945 г. Разрушение самолёта не предусматривалось, но и не исключалось. Надо было сделать двенадцать режимов с перегрузками. На третьем из них Сергей Николаевич не включил самописец. Получалось, что придется выполнить тринадцать режимов. Что ни говори, число «13» оправдало свою недобрую славу: на пятом режиме у самолета отломилось крыло. Лётчику стоило огромных усилий и самообладания сбросить фонарь и выпрыгнуть с парашютом из беспорядочно падающего самолёта.
В результате аварии Сергей Николаевич Анохин получил тяжёлые ранения и потерял левый глаз. Через два месяца после выхода из госпиталя он должен был решить, как жить дальше. Ответ однозначен: только летать! И начались долгие месяцы усиленных тренировок. Анохин использовал самые разнообразные способы разработки глубинного зрения, и его усилия оказались не напрасны. Уже в декабре 1945 г. Сергей Николаевич возвращается к лётно-испытательной работе, причем сразу же его допускают к участию в самых сложных и ответственных заданиях.
В 1947-1948 гг. совместно с С.Амет-Ханом и Н.С.Рыбко Анохин проводит испытания летающих лабораторий ЛЛ-1 (с прямым крылом) и ЛЛ-2 (с крылом обратной стреловидности в 30°) конструкции П.В.Цыбина. Эти летающие лаборатории буксировались на высоту, а после расцепки переводились в пикирование (угол равнялся 45°) с включением порохового двигателя (на 15 секунд). Для изменения центровки применялись заполняемые водой баки в фюзеляже ЛЛ. В полётах на ЛЛ-2 была достигнута максимальная скорость М=0,87. Эти испытания позволили получить большой экспериментальный материал по измерению аэродинамических характеристик, распределению давления по крылу и оперению на околозвуковых скоростях. В полётах также проводилось исследование перемещения скачков уплотнения по крылу.
В августе 1947 г. Анохину присвоена квалификация «лётчик-испытатель 1-го класса», а в 1949 г. – звание полковника.