Наряду со служилыми людьми активное участие в обороне приняли и монахи. Одни сражались на стенах и ходили на вылазки, некоторые из них даже начальствовали над воинскими отрядами, другие готовили пищу для ратных людей, третьи молились и укрепляли воинский дух в осажденных. Сапега и Лисовский писали братии монастыря: «А вы беззаконники… забыли сете… царя Дмитриа Ивановича, князю Василию Шуйскому доброхотствуете и учите во граде Троицком воинство и народ весь сопротив стояти государя царя Дмитрия Ивановича и его позорити и псовати неподобно, и царицу Марину Юрьевну и нас…» Сапега и Лисовский грозили «сидельцам» смертью, но троицкие власти отвечали им грамотами, в которых выражали твердую волю к сопротивлению: «Да весте (знайте. —
Поначалу Сапега и Лисовский пытались захватить монастырь во время решительного штурма, но, потерпев неудачу, приступили к долговременной осаде и приказали готовить подкопы. Против подкопов осажденные делали вылазки, и в ноябре 1608 г. во время жестокого боя уничтожили вражеские укрепления, взорвали подкоп и захватили пушки. Эта победа далась дорогой ценой —174 защитника монастыря были убиты и 66 ранены. Отличился в этом «деле» отряд старца Нифонта Змеева, состоявший из 30 монахов и 200 воинов. Новые ожесточенные бои развернулись в декабре и унесли жизни 325 защитников монастыря. Силы «троицких сидельцев» постепенно таяли, а помощи ждать было неоткуда. Сапежинцы начали охоту на тех, кого посылали из монастыря за водой (в обители замерз водопровод) и дровами, и положение осажденных резко ухудшилось. Внутри монастыря сожгли большинство деревянных построек, забили весь скот и многих боевых лошадей. Начались повальные болезни от голода и холода.
Далеко не все защитники монастыря оказались способны выдержать эти жестокие испытания. Нашлись перебежчики, которые переметались на сторону неприятеля. Тогда же начались конфликты и между начальствующими, посыпались взаимные обвинения в измене. По приказу князя Долгорукого был схвачен монастырский казначей Иосиф Девочкин. Воевода приказал его пытать, что вызвало недовольство среди братии. Воевода писал в Москву Палицыну, что монахи «после Осифова дела всякую смуту начали и мир возмутили». За казначея вступились архимандрит Иосиф и старица Мария Владимировна, племянница Ивана Грозного. Когда же казначей умер от ран и болезней, его с честью погребли в обители. Обвиняли в измене и второго воеводу — Алексея Голохвастова, страдавшего от жестокой цинги, однако его вина не была ничем подтверждена.
Не только в измене, но и в несправедливости обвиняли друг друга «троицкие сидельцы». Стрельцы и монастырские слуги жаловались царю Василию, что не получают достаточного «корма», монастырские власти, наоборот, обвиняли их в жадности и непослушании. Тяжко было раненым — не получая награды за пролитую кровь, они не имели возможности прибегнуть к лекарственной помощи и нормально питаться. «А иные, государь, мы, холопи твои, лежим ранены, а от лечения и на зелье дата печево ж», — жаловались они государю. Более-менее справедливое распределение припасов ввел в осажденной обители только воевода Давыд Васильевич Жеребцов, прорвавшийся в монастырь уже в конце осады и взявший на себя заботу об обеспечении нуждающихся. С этого времени больным и раненым стали давать «на всяк день: из хлебни мяхкой хлеб, да ис поварни шти да каша брацкая, а из келарские по звену рыбы на день человеку». Однако к этому времени большинство защитников монастыря уже умерли от ран, болезней и истощения.
Об измене (мнимой или реальной — неясно) сообщает и письмо несчастной царевны Ксении Годуновой, в иночестве Ольги, находившейся вместе с другими монахинями в осаде, адресованное ее тетке княгине Домне Ноготковой: «И я у Живоначалные Троицы в осаде, марта по 29 день, в своих бедах чуть жива, конечно болна (смертельно больна. —