Небольшая в то время обитель стала одним из форпостов на рубежах столицы. Несколько лет спустя, в Смутное время, монастырь подвергся разорению. Его осаждал гетман Хоткевич, которому противостояло ополчение под руководством князя Дмитрия Трубецкого. Донская обитель была взята и полностью разграблена. Несколько лет спустя, в 1618 году, у стен разоренной Донской обители русские полки дали отпор казакам гетмана Сагайдачного, действовавшего на стороне польского королевича Владислава.
После Смуты восстановление Донского монастыря шло очень медленно. Даже пожертвования из казны, сделанные царем Михаилом Федоровичем – первым государем из династии Романовых, не смогли исправить положения: Донская обитель была бедной и захудалой. Но, несмотря на это, известно, что и царь Михаил Федорович, и его сын царь Алексей Михайлович несколько раз ходили в Донской монастырь на богомолье.
В 1650 году при царе Алексее Михайловиче и Патриархе Иосифе, захудалый Донской монастырь приписали к процветающей Андреевской обители. В таком положении Донской монастырь пробыл два десятилетия, пока на него ни обратила внимание подросшая дочь царя Алексея Михайловича царевна Екатерина Алексеевна.
Благодаря ее вниманию при царе Федоре Алексеевиче обитель вновь обрела независимый статус. В это время на обитель, помимо царевны Екатерины, начинают щедро жертвовать вельможи. Также с конца XVII века Донской монастырь становится центром русско-грузинских связей.
Впоследствии, уже в правление царевны Софьи, в конце XVII века, Донской монастырь стал одним из главных столичных монастырей. Попечением царевны Екатерины, благодаря ее пожертвованиям «из царских сокровищ», в обители был выстроен новый собор Донской иконы Божьей Матери, позже прозванный Большим, и отстроены монастырские стены.
В начале XVIII века настоятелем монастыря назначается глава Имеретинской Грузинской Церкви архимандрит Лаврентий, и с этого времени Сретенская церковь Большого Донского собора становится усыпальницей грузинских царей и князей.
Конец XVII – начало XVIII века вообще были благоприятны для Донской обители. Даже в царствование Петра I, не благоволившего к монастырям, в Донском монастыре продолжалось строительство храмов и их благоукрашение. Впоследствии, уже в середине XVIII века, в Донской обители были отстроены каменные келейные корпуса. В это же время кладбище Донской обители становится очень популярным среди столичной аристократии.
В 1745 году Донской монастырь был причислен к ставропигиальным, то есть подчинявшимся непосредственно Святейшему Синоду и имеющим право самостоятельного выбора архимандрита. Несколько лет спустя, в 1747 году в Донской монастырь из Заиконоспасской обители была переведена Славяно-греко-латинская академия.
Несмотря на процветание, общественные потрясения также не обошли стороной Донскую обитель. В 1771 году в воротах монастыря был убит Московский архипастырь, архиепископ Амвросий (Зертис-Каменский).