Трещина в мироздании

Последовательности CRISPR у S. thermophilus, как было известно Родольфу и Филиппу, обладают определенными необычными свойствами, которые можно было бы использовать в экспериментальной работе. Александру Болотину удалось обнаружить некоторые из этих свойств, когда он секвенировал геном S. thermophilus; позднее Болотин сосредоточился на изучении ДНК CRISPR и в конце концов проанализировал более двадцати различных штаммов. В ходе этой работы он заметил, что, хотя повторяющиеся последовательности CRISPR (заштрихованные черным ромбики на рисунке Джилл) всегда были одинаковыми, спейсерные последовательности (пронумерованные квадратики на том же рисунке) у представителей разных штаммов заметно отличались. Более того, многие из этих спейсеров фактически совпадали с участками фаговых геномов, секвенированными незадолго до этого. (Результаты работы Болотина обобщены в одной из трех статей 2005 года, которые Джилл показывала мне в кафе Free Speech Movement.) Главный вывод из статьи Болотина таков: штаммы S. thermophilus, в CRISPR которых было больше таких спейсеров, оказались более устойчивыми к заражению фагами. Хотя было не особенно понятно, какое это имеет значение, казалось, что бактерии неким образом модифицируют свою ДНК в составе CRISPR, имитируя геномы определенных фагов и совершенствуя собственную иммунную систему – если предположить, что CRISPR является таковой, – чтобы эффективнее бороться с этими вирусами.

Основываясь на работе Болотина, Родольф и Филипп спланировали эксперименты для проверки этого предположения. Действительно ли штамм S. thermophilus способен повышать свою устойчивость к конкретному бактериофагу, вставляя себе в область CRISPR новые фрагменты ДНК, совпадающие с последовательностями ДНК этого фага?

В своих опытах исследователи из Danisco сосредоточились на штамме S. thermophilus, который широко используется в молочной промышленности, и на двух вирулентных фагах, выделенных из образцов фабричного йогурта. Основой методики послужили простейшие генетические эксперименты – подобные проводили с начала XX столетия. Ученые заражали популяции бактерий в отдельных пробирках двумя фагами, инкубировали их 24 часа, а затем проверяли, остались ли в этих культурах живые бактерии, высевая их в чашки Петри и оставляя их на ночь расти. Было обнаружено, что, хотя фаги уничтожили более 99,9 % бактерий, девять новых, мутировавших штаммов S. thermophilus, видимо, были устойчивы к заражению фагами.

В этой части исследования Danisco не было ничего принципиально нового, поскольку другие ученые тоже использовали сходные методы для обнаружения резистентных к фагам штаммов S. thermophilus. Но Родольф и Филипп пошли дальше. Они попытались выяснить, что именно на уровне генов обеспечивает бактериям эту наблюдаемую неуязвимость.

У Родольфа и Филиппа была одна догадка по поводу того, какая часть бактериального генома делала мутировавшие штаммы S. thermophilus устойчивыми к заражению вирусами: они подозревали, что за это отвечает CRISPR, и предполагали, что участки CRISPR у девяти новых мутантных штаммов по строению отличаются от таковых у предкового штамма. И действительно: выделив геномную ДНК из каждого мутантного штамма, исследователи обнаружили, что каждая область с CRISPR расширилась за счет вставки новых кусочков ДНК между повторами. Более того, эти новые спейсеры точно повторяли последовательности ДНК фага, к которому конкретный штамм приобрел иммунитет. Особенно примечательным казалось следующее: благодаря физическому встраиванию в область CRISPR бактериальной ДНК новоприобретенная устойчивость наследовалась и могла передаваться всем последующим поколениям при каждом делении.

Исследователи из Danisco обнаружили еще один способ борьбы бактерий с вирусами – их пятый набор вооружения. Как мы теперь знаем, в дополнение к ранее открытым системам защиты у бактерий имеется (в виде CRISPR) удивительно эффективная система противовирусного адаптивного иммунитета, позволяющая “воровать” кусочки ДНК фагов, когда последние заражают бактерии, и использовать их для обеспечения иммунного ответа в будущем. По выражению Блейка, CRISPR работал как “молекулярная карта” профилактических прививок: сохраняя память о предыдущих фаговых инфекциях в форме спейсерных последовательностей ДНК, запрятанных в рядах из повторов и спейсеров, бактерии могли использовать эту информацию для распознавания и разрушения тех же самых фагов во время новых столкновений с ними.

CRISPR: молекулярная карта профилактических прививок