Серийное производство ТБ-1 развернули на авиазаводе № 22, располагавшемся в Филях. По деталям самолет был, в сущности, иностранной «сборной солянкой»: стальные трубы и шасси – английские, клапаны для трубопроводов – французские, электрооборудование и дюралюминий для фюзеляжа и крыльев – немецкие. Поскольку нормальных цехов для сборки таких больших самолетов не было, их постройка шла одновременно с «рождением» ТБ-1. В 1929-м удалось построить всего два экземпляра бомбардировщика, в 1930-м – 66. Первые 45 машин получали немецкие двигатели BMW, а после того как в Рыбинске начали выпуск его советской копии М-17, все бомбардировщики оснащались ими. На некоторые ставились немецкие двигатели «BMW VlbE7» мощностью 730 лошадиных сил, а после 1935-го машины переоснастили 715-сильными моторами М-17Ф. В процессе выпуска самолеты непрерывно совершенствовались, с 1931 года на них устанавливались советские пулеметы ДА. В дальнейшем ТБ-1 пытались вооружить даже артиллерийскими орудиями. Впервые безоткатную пушку на нем испытали в 1931-м, чуть позже было разработано специальное динамореактивное орудие ДРП-76. Планировали ставить на самолеты баки с отравляющими веществами, «газовые агрегаты» для облегчения взлета. Кроме того, ТБ-1 ставились на поплавки (переоборудовано 66 самолетов) и лыжи, оснащались устройствами, позволявшими перевозить под фюзеляжем мотоциклы и автомобили, а также выбрасывать небольшие десанты парашютистов.
Разрабатывался и радиоуправляемый вариант ТБ-1. В 1933 году одна такая машина № 750 с автопилотом АВП-2 даже поднималась в воздух, но эксперименты с гигантским беспилотником все же были признаны тогда неудачными. В 1935-м была построена даже целая система под названием ТМС-36. Она представляла собой два ТБ-1, которые загружались взрывчаткой. Пилоты поднимали их в воздух, затем спрыгивали на парашютах, а самолет наведения ТБ-3 вел две летающие бомбы до цели. Но на вооружение «телемеханическую систему» так и не приняли, хотя испытания она прошла. Эксперименты в этой области продолжались и позднее. Так, в мае 1939 года ТБ-1 № 712 без экипажа на борту совершил успешный полет без пилота от взлета до посадки.
Также ТБ-1 был задействован в очень популярной в начале 1930-х годов программе «Звено». На крыло бомбардировщика укреплялись два истребителя И-4, которые затем стартовали и выполняли собственные задачи. Первый полет этой конструкции состоялся 3 декабря 1931 года, причем один из истребителей пилотировал В.П. Чкалов. Проект был признан интересным, и в 1932 году в составе ВВС уже планировалось иметь эскадрилью «Звеньев». Помешало этому… быстрое развитие советской авиации: сначала истребители И-4 сменились самолетом И-5, а там и ТБ-1 устарел. Последний полет «Звено-1а» в составе ТБ-1 и двух И-5 совершило в сентябре 1933-го.
В начале 1930-х количество ТБ-1 в составе военно-воздушных сил стремительно увеличивалось. 1 мая 1930-го тяжелый бомбардировщик впервые смогли увидеть все желающие – ТБ-1 пролетели над Красной площадью в рамках первомайского парада. И если в начале 1930-го в РККА имелось всего два новых самолета, то год спустя – уже 52, а в начале 1932 года – 155. Больше всего бомбардировщиков этой модели в войсках насчитывалось в августе 1932 года – 203. Базировались они в Монине, Воронеже, в Кречевицах под Псковом и в Воздвиженке, на Дальнем Востоке. Однако последние ТБ-1 сдали армии в начале 1932-го, и уже с осени этого года в армию начали поступать новые четырехмоторные ТБ-3 (см. отдельную статью). Их «старших братьев» стали переводить в разряд учебных или транспортных машин. В 1935-м оставалось только три эскадрильи, вооруженные этими самолетами; в Ташкенте 13-й легкий бомбардировочный авиаполк летал на ТБ-1 еще летом 1939-го. На сентябрь 1940-го в составе ВВС числилось всего 28 таких машин.