Но широко практиковалось и использование У-2 не только в учебных целях. Массово строилась сельскохозяйственная модификация У-2А, предназначенная для опыления посевов (ее в первую очередь и называли «кукурузником»). Была создана санитарная версия самолета, делались многочисленные попытки строить на базе У-2 «лимузины», т. е. самолеты для перевозки двух-трех пассажиров в комфортабельной закрытой кабине. Выполняли У-2 и агитационные функции. В Сводной особой авиаэскадрилье имени Максима Горького несли службу «именные» самолеты «Биробиджанец», «Комсомольская правда», «Сакко и Ванцетти», «Красная звезда», «Пионерская правда», «Крестьянская газета», «Колхозник ЦЧО», «Горьковский колхозник», «Московский колхозник», «Западносибирский связист», «Колхозник Восточной Сибири», «Колхозная бригада», «Селькор», «Совхозная газета», названные в честь соответствующих периодических изданий и подшефные им.
Поскольку все довоенные У-2 были ленинградского происхождения, после начала Великой Отечественной войны завод по их производству эвакуировали в Казань; последние самолеты в Ленинграде собрали в августе 1941-го. В Казани производством бипланом занялся завод № 387, первый У-2 он выпустил 2 сентября. В ходе войны производство самолета упрощалось с целью удешевления и повышения скорости сборки, так что в 1943-м на один У-2 тратили 1215 часов вместо 3000 на довоенных самолетах. С этого года самолет строили не только в Казани, но и в Долгопрудном, Шумерле, Козловке. Несмотря на трудности военного времени, объемы производства не снижались, а наращивались, и больше всего У-2-5141 было собрано в 1944 году.
Военные годы сделали хорошо знакомый, привычный и любимый летчиками У-2 настоящей легендой. Эти самолеты выполняли на фронте самые разнообразные функции – были разведчиками, самолетами связи, санитарными машинами (У-2С), корректировщиками артогня (У-2НАК), доставляли партизанам боеприпасы и продовольствие и даже вели пропаганду среди войск противника через громкоговоритель (У-2ГН – «голос неба»). Множество самолетов было переоборудовано в легкие ночные бомбардировщики У-2ЛНБ. Такие машины оснащались пулеметом и могли нести 200 килограммов бомб. Обычно это были две фугасные бомбы ФАБ-100 или четыре ФАБ-50. С 1942 года брали по 250 килограммов бомб, а иногда и полтонны. Иногда пилоты оставляли на земле парашюты, предпочитая взять лишние бомбы. Летали У-2 по ночам – днем самолет мог стать легкой добычей истребителей. Однако в качестве ночного бомбардировщика он обладал массой плюсов. У-2 «подкрадывались» к позициям врага на малой скорости и очень низкой высоте, что затрудняло обнаружение самолета средствами ПВО и обеспечивало высокую точность бомбометания. За ночь хорошо подготовленный экипаж У-2 мог осуществить по 12–14 вылетов, перерыв между которыми составлял всего 5–6 минут.
Среди солдат вермахта У-2 получили прозвища «Kaffeemühle» («кофемолка») и «Nähmaschine» («швейная машинка»). Несмотря на внешнюю «несерьезность» самолета, он считался вполне полноценным противником, и неудивительно – отдельные экипажи У-2 имели на своем боевом счету сотни убитых офицеров и солдат врага, десятки взорванных складов, сооружений, укреплений, автомобилей и самолетов.
На фронте У-2 обычно сводились в отдельные авиаполки ночных бомбардировщиков. Из них наибольшую известность получил 46-й гвардейский ночной бомбардировочный авиационный Таманский Краснознамённый ордена Суворова полк, укомплектованный летчицами. Его боевое крещение пришлось на 12 июня 1942 года. Полк принимал участие в боях на Дону, Тамани, Кубани, освобождал Крым, Белоруссию, Польшу и завершил войну на Одере. За время войны У-2 Таманского полка уничтожили и повредили 17 переправ, 9 поездов, 2 железнодорожные станции, 26 складов, 12 цистерн с горючим, 176 автомобилей, 86 огневых точек. Потери полка составили 23 человека и 28 самолетов. Среди противника летчицы полка получили прозвище «ночные ведьмы».