В сентябре 1941 года на фронте появились первые ночные легкобомбардировочные полки, укомплектованные самолетами Р-5 и Р-Z. Машины забирали у летных школ, ГВФ и Осоавиахима, причем брали даже некомплектную и законсервированную технику. Сроки формирования этих полков были крайне сжатыми, мастерство летчиков в большей части низким. Иногда курсанты отправлялись в боевые вылеты буквально через 3–4 самостоятельных ночных полета. Тем не менее Р-5 и Р-Z этих полков вели активную боевую работу, а их экипажи зачастую совершали настоящие подвиги. Так, 7 октября 1941 года младший лейтенант И.С. Денисов на Р-5 таранил под Москвой германский «Henschel 126». В ноябре 1941-го из всех советских бомбардировщиков, участвовавших в битве за Москву, более 65 % приходилось на «ночники», т. е. на Р-5, Р-Z и У-2. При этом у более мощного Р-5 было несколько преимуществ перед У-2: он имел больший радиус действия, брал на борт больше бомб, обладал высокой скоростью и оборонительным пулеметным вооружением. В умелых руках Р-5 мог быть вполне грозным оружием. Так, осенью 1941 года под Ростовом Р-5, отбиваясь от насевшего на него «Messerschmitt 109», сбил его пулеметным огнем. В другой раз, когда на П-5 навалились сразу три «мессершмитта» и биплан был подожжен ими, советские летчики сумели сбить один из немецких истребителей и успешно посадили свою машину. Описан также случай, когда в августе 1941-го Р-5 дерзко атаковал пару бомбардировщиков «Junkers 88»; на одном он повредил двигатель, и немецкие пилоты поспешно ретировались.
В составе ГВФ мирных версий разведчика насчитывалось гораздо больше – в августе 1941-го 139 П-5 и 139 ПР-5. Из них на фронте сформировали шесть авиагрупп и три отряда, на плечи которых легли разнообразные вспомогательные задачи. Бипланы служили для переброски продовольствия, медикаментов, боеприпасов, эвакуировали раненых, доставляли срочные сообщения. Так, для фельдъегерской связи была создана специальная отдельная авиагруппа связи, чьи П-5 возили важные штабные донесения из тыла на фронт. С осени 1941 года «фронтовые» П-5 начали вооружать пулеметами ШКАС или ДА, а то и гранатометами. В 1941 году в боях были потеряны 23 самолета, но зато ВВС передали в структуры ГВФ 71 разведчик Р-5. В начале зимы 1942 года в авиаотрядах ГВФ воевали 124 П-5 и 102 ПР-5. Многие из них добивались отличных результатов. Так, когда в августе 1942-го группа П-5 обнаружила немецкий аэродром Ругозеро в Карелии, то атаковала его, вызвав большой пожар и принудив противника отказаться от массированного налета на Архангельск, который планировался с этого аэродрома. Помимо этого, самолеты выполняли также связные и разведывательные функции. Из Карелии Р-5 и П-5 забрасывали небольшие разведгруппы даже в Северную Норвегию, т. е. находились в воздухе по шесть – восемь часов, пролетая над территорией вражеской Финляндии.
В середине войны бомбардировочные полки на Р-5 были активно задействованы в Сталинградской и Курской битвах, сражении за Кавказ. В 1943-м некоторые П-5 начали оснащать реактивными снарядами РС-82. Летчик В.Д. Никитов из 5-го отряда ГВФ с помощью таких ракет атаковал и уничтожил вражеский эшелон с боеприпасами, несмотря на то что охранявшие поезд зенитки добились нескольких попаданий в его машину. Именно в боевых условиях выявилось одно из лучших качеств поликарповского шедевра – живучесть: Р-5 летали, даже будучи превращенными буквально в решето. Так, в апреле 1944 года один П-5 трижды за ночь попал под вражеский огонь, причем повреждения были очень серьезными, и тем не менее самолет благополучно совершил посадку на партизанском аэродроме.
Именно во время одного такого полета к партизанам был совершен самый легендарный подвиг, связанный с Р-5. В полете самолет старшего лейтенанта Александра Петровича Мамкина, вывозившего за линию фронта детей, их воспитательницу и двоих раненых, был атакован немецким истребителем. Перегруженный Р-5 загорелся, но продолжал лететь. Летчик был ранен, на нем горели комбинезон и унты, огонь уже добрался до рук, сжимавших штурвал. Но Мамкин ценой неимоверных усилий смог дотянуть до линии фронта и посадить Р-5 у своих. У подбежавших солдат офицер спросил только «Дети живы?» и потерял сознание. Все спасенные им дети выжили, а герой-летчик скончался от обширных ожогов. Награды за свой подвиг он так и не был удостоен (к ордену Красного Знамени, который он получил посмертно, его представили еще при жизни).
Участвовали Р-5 и в советско-японской войне 1945 года. Они использовались как связные, вели фоторазведку и поиск больших групп японских военных, отрезанных от основных сил и продолжавших сопротивление.
Всего в 1930–1935 годах было выпущено 4649 экземпляров разведчика Р-5, а вместе с его версиями общее количество самолетов этого типа приближается к восьми тысячам. Очень надежный, мощный, скоростной и хорошо вооруженный, этот самолет занимал заметное место в советской авиации 1930-х и достойно показал себя в небе Великой Отечественной войны, а отдельные его экземпляры дожили и до послевоенного времени.