Все свидетельствовало о том, что в новом браке Маргарита наконец обрела личное счастье. Но это счастье оборвалось после того, как герцог Филиберт II жарким летом 1504 года от скуки отправился на охоту на диких кабанов. Вспотев, он залпом выпил ледяной воды, чтобы охладиться, и заболел. Несколько дней спустя Филиберт II умер от воспаления легких. Маргарита снова овдовела. До завершения строительства новой церкви и монастыря на месте обветшавшего монастыря Бру она похоронила мужа в церкви в Бурк-ан-Брессе и отправилась в Страсбург, чтобы обсудить с Максимилианом вопрос наследства. Переговоры Маргариты с отцом, скорее всего, были не только о наследстве, поскольку за полгода до этого умерла королева Испании Изабелла Кастильская. С ее смертью политическая обстановка в Европе снова изменилась.
«Все, что принадлежит королю и королеве, принадлежит мне и после их смерти достанется мне»
Вскоре после смерти принца Хуана в октябре 1497 года королева Изабелла тяжело заболела. С этого момента она перестала играть значительную роль в политике. Управление Кастилией перешло к ее супругу Фердинанду. В конце сентября 1504 года он написал Филиппу письмо о том, что состояние королевы резко ухудшилось и ей осталось жить несколько недель. Фердинанд хотел, чтобы Хуана приехала в Испанию для объявления ее señora natural propietaria, единственной законной наследницей Кастилии. Филипп отказался удовлетворить эту просьбу и приказал послам не сообщать Хуане о здоровье матери. В отличие от Хуаны, объявленной прямой наследницей, Филипп имел ограниченный статус принца-консорта. Соответственно, он не мог претендовать на власть над Кастилией.
Присутствие Хуаны могло только помешать задуманному Филиппом государственному перевороту и захвату королевской власти. Когда пошли слухи о том, что Хуане стало обо всем известно и она решила бежать в монастырь, чтобы оттуда отправиться в Испанию вместе с маленьким Карлом, Филипп не позволил ей это сделать. Хуану изолировали в замке на холме Куденберг в Брюсселе. Ее испанским советникам был запрещен доступ в ее покои, а тех, кто осмеливался ее посетить, сразу заключали под стражу. Хронисты писали, что Хуана в отчаянных попытках сбежать взломала ломом деревянный пол в своих покоях с криками, что «лучше умереть, чем допустить то, что замышляет Филипп!».
Буйное поведение Хуаны стало для Филиппа идеальным поводом для того, чтобы объявить ее недееспособной и претендовать на кастильский трон. Испанские принцессы Мария и Екатерина были выданы замуж за короля Португалии Мануэля I и Артура Тюдора, принца Уэльского. У них не было никаких прав на трон. Филипп открытым текстом сообщил испанскому послу Фуэнсалиде: «Все, что принадлежит королю [Фердинанду] и королеве [Изабелле], принадлежит мне и после их смерти достанется мне». Посол, отлично помнивший напряженность первого бургундского визита в Испанию, предупредил Филиппа в ответном письме, что его в Испании не ждут: «В Испании против вас не только народ, но даже камни».
Отношения между Фердинандом и его зятем Филиппом испортились еще больше после оглашения завещания королевы Изабеллы. Вместе со своим последним вздохом Изабелла решительно перекрыла амбициозному зятю путь к испанскому трону. Согласно ее воле, Фердинанд становился регентом Кастилии до совершеннолетия их внука Карла в случае отказа Хуаны от регентства или ее объявления недееспособной. Изабелла собственноручно добавила в текст завещания слова «объявления недееспособной» незадолго до смерти, тем самым дав понять, что правильно оценивает психическое здоровье дочери и существующую угрозу захвата власти в Кастилии со стороны Бургундско-Габсбургской династии.
Королева всегда недолюбливала зятя. Изабелла не могла смириться с тем, что Филипп никогда не следовал ее советам и изолировал Хуану от испанского и бургундского дворов. Испанские послы, со своей стороны, представляли ей Нидерланды далеко не самым лучшим образом. Их отчеты изобиловали жалобами на частые домашние ссоры, нехватку денег, холодный климат, постоянные дожди и суровые зимы, из-за которых все болели, уродливый и непонятный для них язык, безвкусную еду, которую готовят на сливочном масле вместо оливкового, отсутствие таких трав, как тимьян и лаванда, а также чрезмерное, по их мнению, бургундское обжорство и пьянство. Не случайно набожные испанцы порицали бургундские излишества.