Генетический детектив. От исследования рибосомы к Нобелевской премии

Первые кристаллы рибосом были ужасного качества и практически не давали дифракционных пятен. Но Аду Йонат это не смущало. Вместе со своим давним коллегой Франсуа Франчески, который курировал опыты по кристаллизации в Берлинском институте, она настойчиво продолжала синтезировать все более качественные кристаллы. Кроме того, Ада вела исследования у себя в лаборатории в Институте Вейцманна в Израиле. На тот момент израильские ученые открывали новые виды животных, чтобы точнее охарактеризовать локальное биоразнообразие. В частности, они обнаружили микроорганизм под названием Haloarcula marismortuii. Эта бактерия существует в суровых условиях экстремально соленого Мертвого моря, то есть является экстремофилом. Позже выяснилось, что

Haloarcula – не бактерия, а архея и по сложности рибосом занимает промежуточное положение между бактериями и эукариотами. Ада подумала, что стоит кристаллизовать рибосомы этого организма. Большие субъединицы из них действительно кристаллизовались качественнее, чем какие-либо другие, но их атомную структуру Ада смогла разгадать только после многократного регулирования условий выращивания кристаллов.

Вместе с тем существовала проблема снятия данных. Как правило, кристалл вращают, подставляя его под пучок рентгеновских лучей, чтобы сделать серию снимков и измерить рассеянные рентгеновские лучи в детекторе. При любой ориентации кристалла некоторые его плоскости будут удовлетворять закону Брэгга и давать дифракционные пятна в определенных направлениях. Собрав все возможные пятна, вы получите данные для вычисления структуры кристалла.

Работать с кристаллами рибосом было особенно сложно, поскольку дифракционные пятна от них были слабыми. Дело в том, что выраженность пятен зависит от количества молекул (пятно – результат общего вклада лучей, рассеянных от молекул), каковых в рибосомах больше, чем в типичных белках. Чтобы рассмотреть кристалл целиком, требовалось надолго подставить его под интенсивный пучок рентгеновских лучей, вызывающий в молекулах изменения их внутренней структуры и позиции, а также впускающий в структуру свободные радикалы. След рентгеновского луча на крупном кристалле имеет особый оттенок, дифракционные пятна под большим углом тускнеют и исчезают, пока идет облучение.

Кристаллографы говорят, что кристалл «погибает» в рентгеновских лучах. При работе с маленькими белковыми молекулами можно собрать достаточную информацию с одного кристалла, либо, если он стал «погибать», переходить к новым кристаллам, пока все интересующие данные не будут собраны. В случае с кристаллом рибосомы не удается собрать воедино даже первую дифракционную картину: еще до завершения подготовки первого снимка некоторые пятна уже могут исчезнуть.

Наконец ученые догадались, что, если охлаждать кристаллы, то удастся замедлить диффузию свободных радикалов, возникающих под действием рентгеновских лучей, и снизить ущерб. Первые реальные доказательства о работоспособности такого механизма дали Дэвид Хаас, на тот момент – постдок в Институте Вейцманна в Израиле, и Майкл Россманн из Университета Пердью. Как и многие представители своего поколения, Россманн начал карьеру в LMB, работая у Макса Перуца над изучением первых структур гемоглобина. Сегодня он светило науки. Ему уже за восемьдесят, но он успешно руководит группой и ведет столь активный образ жизни, что, говорят, до сих пор поднимается в горы быстрее своих пост-доков и студентов. Хаас и Россманн решили остудить кристаллы фермента до –75 °C и обратили внимание, что дифракционные пятна от них стали исчезать значительно медленнее. Но кристаллы, наполовину состоящие из воды и выглядящие правильными, на деле оказываются дряблыми, как медуза, или рассыпчатыми, как сыр. Белковые молекулы имеют неправильную форму, между ними мало точек соприкосновения и много водных «проток», которые при сильной заморозке превращаются в лед и распирают кристалл. Грег Пецко, на тот момент работавший в MIT, заменил водный раствор в кристаллах своеобразным антифризом.

По каким-то причинам эти методы еще долго не могли закрепиться – возможно, потому, что плохо поддавались обобщению. Первыми на них обратили внимание специалисты по электронной микроскопии, чьи препараты также подвергались электронному облучению. Жак Дюбоше, работавший в Европейской молекулярно-биологической лаборатории (EMBL) в Гейдельберге, обнаружил, что, если быстро бросать образцы в жидкий этан, вода не успевает превращаться в лед. Она витрифицировалась (становилась похожей на стекло), сохраняя биомолекулы в естественном состоянии.

Тем временем норвежец Хокон Хоп, работавший в Калифорнийском университете в Дэвисе, занимался сбором данных на материале нескольких мелких органических молекул, легко окислявшихся при комнатной температуре.