Интернет-журнал "Домашняя лаборатория", 2008 №1

— между клетками растений и микроорганизмов устанавливаются метаболические взаимодействия, которые могут привести к стимуляции видоспецифических биосинтезов растительных клеток.

Ассоциации каллусных тканей с цианобактериями получали двумя способами:

— использовали изолированные протопласты, выделенные из дефицитных по хлорофиллу участков мезофилла листа,

— использовали каллус, выделенный из бесхлорофильного участка листа, к которому подсевали суспензию A.variablis.

При этом каллусные культуры стабильно росли не менее 2 лет. Антагонизма не было.

Добавляя в среду ауксины и цитокинины, удалось вызвать органогенез у каллуса табака, ассоциированного с цианобактерией. Сформировались белые побеги регенерантов табака с участками сине-зеленого цвета, содержащими бактерии. В регенерантах из каллуса цианобактерии имели внутритканевую локализацию и обнаруживались только в листьях. Их также находили на поверхности листа, стебля (рис. 26), в сосудистой системе, устьицах.

Рис. 26. Цепочки Anabaena variabilis в углублениях складчатой поверхности стебля табака

_{(по Р. Г. Бутенко и др., 1987)}

Результаты по получению ассоциаций цианобактерий с растениями — регенерантами представляют интерес в связи с проблемой повышения доли биологически связанного азота в азотном питании растений.

МЕТОДЫ СОХРАНЕНИЯ ГЕНОФОНДА

При получении клеточных линий с полезными признаками встает проблема сохранения этих признаков. Растения могут хранить генетическую информацию в семенах, однако этот источник не вполне надежен, так как со временем из-за мутаций всхожесть семян падает. Кроме того, некоторые растения размножаются только вегетативно. Этим обусловлена необходимость сохранения части материала in vitro. С другой стороны, в некоторых случаях удается получить новые клеточные линии, синтезирующие большее количество вторичных метаболитов, то есть более продуктивные, которые тоже нуждаются в сохранении.

Для исследования физиологических и биохимических процессов, протекающих в тканях, также требуются стандартные исходные культуры, чем вызвана необходимость сохранять материал в течение определенного промежутка времени, когда идут серийные эксперименты. Все это делает проблему сохранения генофонда весьма актуальной.

Можно, конечно, пассировать и перевивать клеточные культуры. Однако при этом возникает опасность сомаклональной изменчивости, накопления мутаций, контаминаций (заражения чужеродным генетическим материалом). Это также требует определенных финансовых и трудовых затрат (необходимость частых пересадок, расходы, связанные со средой и т. д.). Цель исследователей состоит в увеличении интервала между пересадками. Существует разные подходы к сохранению куль-

— криосохранение,

— замедление роста,

— сушка (распылительная и лиофильная) — для клеток микроорганизмов.

Криосохранение

Криосохранение — замораживание при сверхнизких температурах. Обычно его проводят в жидком азоте, при температуре -196 °C.

Успех низкотемпературной консервации зависит от ряда факторов:

— вид и тип клеток,

— их концентрация в суспензии,

— состав среды для консервирования,

— вид и концентрация криопротектора,

— режим охлаждения и отогрева,

— способ реабилитации клеток после отогрева.

Существенную роль в успешном замораживании клеток играет их морфофизиологическое состояние: клетки, находящиеся в стационарной фазе роста, менее устойчивы к повреждающему действию низкотемпературной консервации, чем клетки, находящиеся в экспоненциальной фазе роста. Клетки для замораживания отбирают в середине экспоненциальной фазы ростовой кривой.

Немаловажное значение имеет и плотность замораживаемой суспензии. Оптимальные результаты по восстановлению клеток были получены при замораживании клеточной суспензии плотностью 1∙10^5-5∙10⁶ клеток в 1 мл.

Для растительных клеток часто требуется предварительное культивирование в особых условиях. В среду добавляют различные вещества, например:

— 2–6 % маннит или сорбит для уменьшения размера вакуолей;

— аминокислоты, в первую очередь пролин, который служит для связывания воды в клетке (концентрация до 1 моля или 11,5 %), аспарагин, γ-аминомасляную кислоту слоту;

— диметилсульфоксид (ДМСО), который добавляют к среде для предкультивирования в концентрации от 2,5 до 10 % на 48 часов для увеличения проницаемости цитоплазматической мембраны;

— кроме того, применяют искусственное закаливание к холоду, когда снижают температуру культивирования, имитируя естественный осенний процесс подготовки к периоду зимнего покоя (применим только для растений умеренного климата). Клеточные культуры выдерживают несколько суток при температуре +8 — +10 °C, а затем при +2 — +5 °C в течение 1–6 недель.

Процесс замораживания растительных клеток от животных отличает, в основном, наличие этапа предварительного культивирования.