Интернет-журнал "Домашняя лаборатория", 2008 №1

Криопротекторы — вещества, позволяющие снизить повреждающее действие физико-химических факторов при криоконсервировании. К ним относятся сахароза, декстран, этиленгликоль, поливинилпирролидон, диметилсульфоксид (ДМСО), глицерин. Для определения токсичности криопротектора клетки выдерживают при комнатной температуре в различных его концентрациях в течение 30–50 минут, после чего определяют их жизнеспособность. Дополнительно оценивают его протективные свойства путем пробного замораживания и оттаивания культур. Наиболее часто в качестве криопротекторов используют глицерин и ДМСО. Перед добавлением криопротектора суспензию клеток концентрируют путем центрифугирования, надосадочную жидкость сливают. Криопротекторы вносят в культуру за час до замораживания, что приводит к изменению проницаемости мембраны, изменению точки замерзания и оттаивания.

Программы охлаждения могут быть различными, но для всех них характерна медленная скорость охлаждения. При замораживании происходит образование льда внутри и снаружи клеток. Характер этих изменений зависит от изучаемого образца и обработки криопротекторами, но главным образом, от скорости охлаждения. При медленном охлаждении происходит образование внеклеточного льда, приводящее к обезвоживанию клетки до того, как будет достигнута точка замерзания цитоплазмы. При быстром охлаждении клетки быстрее замораживаются изнутри, медленнее обезвоживаются, что приводит к образованию кристаллов льда внутри клетки. В этом случае клетки повреждаются. Обычно охлаждение проводят в два этапа (рис. 27):

Рис. 27.Замораживание клеток:

_а)

быстрое, б) медленное, поэтапное

1. От +20 до -28 °C со скоростью 1 градус в минуту (для растительных клеток скорость замораживания 0,5 градуса в минуту до -35 °C), выдерживают при этой температуре 15 минут.

2. Погружение в жидкий азот (мгновенное охлаждение до — 196 °C)

Замораживание производят в специальных аппаратах. При их отсутствии — на спиртовой бане (0,5–1 литр спирта наливают в термос с металлической колбой, погружают в него ампулы на 15 минут и добавляют при помешивании жидкий азот или сухой лед; доводят температуру до -32 °C (температура должна быть не выше -28 и не ниже -32 °C). Далее переносят ампулы в жидкий азот.

При размораживании ампулы пинцетом переносят в водяную баню с температурой +37 — +40 °C, ампула объемом в 1 мл размораживается в течение 0,5–1 минуты.

После размораживания клетки отмывают либо в ростовой среде (животные), либо в поддерживающей среде. Растительные клетки также можно отмывать 3-10 % раствором сахарозы.

Далее клетки проверяют на жизнеспособность с помощью витальных красителей, окрашивающих мертвые клетки. Окончательным критерием служит четкое возобновление роста на стандартных питательных средах, используемых для данной культуры.

Перевиваемые культуры животных клеток после размораживания имеют повышенную чувствительность к вирусам, которая проявляется в течение первых двух пассажей. Далее чувствительность возвращается к исходной.

Замедление роста

Замедления роста можно добиться следующими методами:

1. Хранение под слоем минерального масла (для бактериальных и грибных культур).

2. Изменение газового состава и атмосферного давления внутри культурального сосуда.

3. Изменение светового режима.

4. Охлаждение до температуры прекращения активного роста.

5. Применение гормональных и осмотических ингибиторов. Из гормональных ингибиторов наиболее часто используют хлорхолинхлорид (для растительных клеток), из осмотических — маннит в концентрации 3–6 %.

6. Замена СаСL₂ на Са(NО₃)₂ в питательных средах.

Для картофеля в качестве способа, позволяющего сохранить генофонд, рекомендуется клубнеобразование в пробирках.

БЕСКЛЕТОЧНЫЕ СИСТЕМЫ

Мембраны хлоропластов

Американский ученый М. Кальвин, чьи исследования в области изучения механизма фотосинтеза были отмечены Нобелевской премией, в 1972 году выдвинул идею создания фотоэлемента, в котором в качестве источника электрического тока служили мембраны хлоропластов. Основной компонент таких мембран — хлорофилл, способный при освещении отдавать и принимать электроны. В качестве проводника, контактирующего с хлорофиллом, Кальвин использовал оксид цинка. Мембраны, содержащие хлорофилл, помещали в раствор ферментов, действующих как катализаторы ЭТЦ. На свету происходит фотолиз воды: Н₂O —> Н₂ + ¹/₂ O₂. При освещении этой системы в ней также возникал электрический ток плотностью 0,1 мкА на см². Такой фотоэлемент функционировал недолго, поскольку хлорофилл вскоре терял способность отдавать электроны. Для того чтобы продлить время действия фотоэлемента, был использован дополнительный источник электронов — гидрохинон. В такой системе хлорофилл отдавал не только свои электроны, но и электроны гидрохинона. Полученный таким образом фотоэлемент площадью 10 м² может обладать мощностью 1 кВт.