Интернет-журнал "Домашняя лаборатория", 2008 №1

Полимеразную цепную реакцию используют для анализа индивидуальных вариаций последовательности нуклеотидов определенных локусов, для повышения эффективности клонирования целевых последовательностей изучаемых геномов и их прямого секвенирования, для детекции в организме патогенных микроорганизмов и т. п.

Используя 32Р-меченные синтетические олигонуклеотиды, можно выявлять единичные замены нуклеотидов в выбранных локусах геномной ДНК человека (или других организмов). Для этого в обычном варианте метода исследуемую ДНК гидролизуют рестриктазами, фракционируют электрофорезом, переносят разделенные фрагменты по Саузерну на нитроцеллюлозный фильтр, который гибридизуют с данным меченым олигонуклеотидом в условиях, при которых даже точечная замена нуклеотидов в анализируемой последовательности приводит к разрушению комплекса ДНК-олигонуклеотид.

Использование полимеразной цепной реакции для амплификации анализируемого локуса позволяет существенно упростить рассмотренный подход и повысить его чувствительность и специфичность. При этом для анализа аллельных вариантов генов достаточно всего 1 нг геномной ДНК человека, а гибридизацию можно проводить с негидролизованной рестриктазами ДНК, иммобилизованной на нитроцеллюлозном фильтре в виде небольшого пятна. Такой вариант метода позволил разработать новые диагностические тесты на генетические и инфекционные заболевания. В частности, этот подход используют для ранней диагностики наличия в организме вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), что не удается осуществить другими методами. При этом не требуется работать с радиоактивными изотопами, так как амплифицированный сегмент вирусной ДНК выявляется напрямую после электрофоретического разделения ДНК и окраски их бромистым этидием.

Метод ПЦР позволил проанализировать наличие последовательностей вирусов папилломы человека в срезах биопсий новообразований шейки матки человека, залитых парафином за 40 лет до данного исследования. Более того, с помощью ПЦР удалось амплифицировать и клонировать фрагменты митохондриальной ДНК из ископаемых останков мозга человека возраста 7 тысяч лет!

На лизатах индивидуальных сперматозоидов человека продемонстрирована возможность одновременно анализировать два локуса, расположенных на разных негомологичных хромосомах. Такой подход обеспечивает уникальную возможность тонкого генетического анализа и изучения хромосомной рекомбинации, ДНК-полиморфизма и др. Метод анализа индивидуальных сперматозоидов сразу нашел практическое применение в судебной медицине, так как HLA-типирование гаплоидных клеток позволяет определять отцовство или выявлять преступника (комплекс HLA представляет собой набор генов главного комплекса гистосовместимости человека; локусы комплекса HLA — наиболее полиморфные из всех известных у высших позвоночных: в пределах вида в каждом локусе существует необычайно большое число разных аллелей — альтернативных форм одного и того же гена).

Используя ПЦР, можно выявлять правильность интеграции чужеродных генетических структур в заранее определенный район генома изучаемых клеток. Суммарная клеточная ДНК отжигается с двумя олигонуклеотидными затравками, одна из которых комплементарна участку хозяйской ДНК вблизи точки встраивания, а другая — последовательности интегрированного фрагмента в антипараллельной цепи ДНК. Полимеразная цепная реакция в случае неизмененной структуры хромосомной ДНК в предполагаемом месте встройки приводит к образованию фрагментов одноцепочечной ДНК неопределенного размера, а в случае запланированной встройки — двухцепочечных фрагментов ДНК известного размера, определяемого расстоянием между местами отжига двух праймеров. Причем степень амплификации анализируемого района генома в первом случае будет находиться в линейной зависимости от количества циклов, а во втором — в экспоненциальной. Экспоненциальное накопление в процессе ПЦР амплифицируемого фрагмента заранее известного размера позволяет визуально наблюдать его после электрофоретического фракционирования препарата ДНК и делать однозначное заключение о встройке чужеродной последовательности в заданный район хромосомной ДНК.

ВВЕДЕНИЕ НОВОГО ГЕНА В КЛЕТКУ

Ввести рекомбинантный ген в клетку можно 2 способами: используя вектора или путем прямого введения.

Требования к векторной ДНК, ее состав

Вектор — молекула ДНК или РНК, состоящая из двух компонентов: векторной части (носителя) и клонируемого чужеродного гена. Задача вектора — донести выбранную ДНК в клетку-рецепиент, встроить ее в геном, позволить идентификацию трансформированных клеток, обеспечить стабильную экспрессию введенного гена.