Интернет-журнал "Домашняя лаборатория", 2008 №1

Это явление получило название аттенуации, а участок ДНК — аттенуатор (ослабитель). Как и репрессия, аттенуация зависит от присутствия в среде соответствующих аминокислот. Например, избыток триптофана в клетках триптофанзависимых мутантов, дефектных по репрессору, только 1 из 10 молекул РНК-полимеразы, начавших транскрипцию, преодолевает аттенуатор и считывает структуру генов. Удаление триптофана втрое повышает эффективность транскрипции генов. В отличие от репрессии, антенуация зависит не от самой аминокислоты, а от триптофанил — тРНК (аминокилоты, присоединенной к соответствующей тРНК).

На эффективность продуктивности рекомбинантной ДНК в существенной степени влияет количество копий этой ДНК в расчете на клетку. Суммарная активность экспрессируемого гена растет с ростом копийности плазмиды. Таким образом, используя многокопийные плазмиды, можно достичь сверхсинтеза нужных белковых продуктов. Обычно используемые плазмидные векторы (pBR 322 и др.) поддерживаются в клетке в количестве 20–50 копий. Сейчас исследователи имеют в своем распоряжении температурно-чувствительные мутантные плазмиды, способные накопить до одной-двух тысяч копий на клетку, не нарушая ее жизненно-важных функций. Таким образом, можно достичь сверхпродукции плазмидных генов бактериальными штаммами-сверхпродуцентами.

Регуляция экспрессии у Е. coli происходит также и на уровне трансляции. Последовательность оснований длиной 6–8 нуклеотидов, расположенная непосредственно перед инициирующим кодоном АУГ, определяет эффективность трансляции.

Эта последовательность представляет собой участок связывания мРНК с рибосомой. Как правило, он отстоит на 8 нуклеотидов от инициирующего кодона, и его сдвиг в ту или иную сторону может резко снижать эффективность трансляции соответствующей мРНК. Описанный участок называется последовательностью Шайна-Дальгарно, по имени исследователей, впервые его идентифицировавших.

В состав вектора кроме всего прочего должен входить маркерный ген, позволяющий селектировать измененные клетки. Часто в качестве селективных используют широко распространенные в природе гены ферментов, модифицирующих антибиотики и инактивирующие их действие.

Особенности организации генома эукариот

У эукариотических организмов механизм регуляции транскрипции гораздо более сложен. В результате клонирования и секвенирования генов эукариот обнаружены специфические последовательности, принимающие участие в транскрипции и трансляции.

Для эукариотической клетки характерно:

1. Наличие интронов и экзонов в молекуле ДНК.

2. Созревание и-РНК — вырезание интронов и сшивка экзонов.

3. Наличие регуляторных элементов, регулирующих транскрипцию, таких как:

а) промоторы — 3 вида, на каждый из которых садится специфическая полимераза. Pol I реплицирует рибосомные гены, Pol II — структурные гены белков, Pol III — гены, кодирующие небольшие РНК. Промотор Pol I и Pol II находятся перед участком инициации транскрипции, промотор Pol III — в рамках структурного гена.

б) модуляторы — последовательности ДНК, усиливающие уровень транскрипции;

в) усилители — последовательности, усиливающие уровень транскрипции и действующие независимо от своего положения относительно кодирующей части гена и состояния начальной точки синтеза РНК;

г) терминаторы — специфические последовательности, прекращающие и трансляцию, и транскрипцию.

Эти последовательности по своей первичной структуре и расположению относительно инициирующего кодона отличаются от прокариотических, и бактериальная РНК-полимераза их не "узнает". Таким образом, для экспрессии эукариотических генов в клетках прокариот нужно, чтобы гены находились под контролем прокариотических регуляторных элементов. Это обстоятельство необходимо учитывать при конструировании векторов для экспрессии.

Типы векторов для введения гена в клетку

Существует несколько типов векторов:

Бактериальные плазмиды

Основная масса клеточной ДНК бактерий содержится в хромосоме (в хромосоме Е. coli, например, 4 млн. пар нуклеотидов). Однако кроме хромосом бактерии содержат большое количество очень маленьких кольцевых молекул ДНК плазмид длиной несколько тысяч пар оснований (молекулярная масса от 1,5 до 300 мегадальтон, 1 МД = 1500 п. о). Такие мини-хромосомы называют плазмидами.

Как правило, плазмиды имеют в своем составе гены устойчивости к антибиотикам, ионам тяжелых металлов (R-плазмиды), а также гены, контролирующие катаболизм некоторых органических соединений (плазмиды биодеградации, или D-плазмиды). Поскольку эти гены находятся в плазмидах, они представлены гораздо большим числом копий. Высокая копийность плазмид обеспечивает клетке синтез большого количества ферментов, химически нейтрализующих антибиотики или ксенобиотики, что и обеспечивает устойчивость к последним. Плазмиды, по-видимому, вездесущи, так как их выделяют из разных штаммов и видов бактерий, но не являются обязательными компонентами генома, а в некоторых природных штаммах плазмиды не обнаружены вообще.