Интернет-журнал "Домашняя лаборатория", 2008 №1

3. Сырая и сухая масса. Суспензия клеток фильтруется через смоченный и взвешенный фильтр, вложенный в воронку Бюхнера под слабым вакуумом. Клетки промывают дистиллированной водой, оттягивают воду под вакуумом и взвешивают снова вместе с фильтром. Сухая масса — определяется аналогично, но взвешивается сухой фильтр, а клетки сушат вместе с фильтром в термостате при 60 °C до постоянной массы.

4. Содержание белка. Для определения белка клетки собирают на фильтре из стекловолокна, дважды промывают кипящим раствором 70 % этанола, сушат ацетоном, гидролизуют 1М NaOH при температуре 85 °C полтора часа. Затем фильтруют и определяют белок по Лоури.

5. Проводимость среды. Определяют с помощью кондуктометра. Как правило, она обратно пропорциональна свежей массе клеток.

6. Жизнеспособность клеток. Оценивают, изучая движение цитоплазмы под микроскопом, а также с помощью прижизненных красителей (флюоресцеиндиацетат, соли тетразолия, синий Эванса). Перед использованием подбирают pH инкубационного буфера, концентрацию красителя, время инкубации, строят калибровочные кривые для смеси живых и убитых клеток.

По полученным данным строят ростовые кривые, которые имеют S-образную форму и состоят из нескольких участков: 1 — латентная, или лаг-фаза, где видимый рост не наблюдается ни по одному из критериев; 2 — экспоненциальная, рост с ускорением; 3 — линейная, где скорость роста постоянна; 4 — фаза замедленного роста; 5 — стационарная фаза; 6 — фаза деградации клеток (рис. 11)[68]

.

Реальная ростовая кривая может несколько отличаться от модельной. На форму ростовых кривых влияют и генетическая характеристика популяции (вид растения), и количество инокулята, и условия выращивания (состав среды, начальное значение pH, состав газовой фазы, скорость перемешивания).

Необходимо отметить, что ростовые кривые для разных критериев не идентичны. Дисбаланс между скоростями клеточного размножения (число клеток), синтеза структурных элементов клетки (сухая масса) и увеличения объема и содержания вакуолей (сырая масса) отражает специфику онтогенеза высшего растения.

Для глубинного культивирования растительных клеток применимы способы, разработанные в микробиологии. Различают два вида систем культивирования: открытую и закрытую.

Для закрытой системы характерен периодический режим выращивания. Клеточная масса (инокулят) помещается в определенный объем среды. Система закрыта по всем параметрам, кроме газов, до конца выращивания. Периодически подается свежая питательная среда, а старая удаляется в том же объеме. Клетки остаются в системе в течение всего цикла выращивания.

Открытые (проточные) культуры характеризуются поступлением свежей питательной среды, при котором отбирается не только старая питательная среда, но и часть урожая клеточной массы.

Наиболее изучено и распространено закрытое глубинное культивирование. Для аэрации и перешивания используют различную аппаратуру: роллеры, качалки, магнитные мешалки и т. д. Очень большое значение для роста и биосинтеза клеток in vitro имеют технические характеристики систем культивирования. При масштабировании от небольших по объему культур в колбах до больших многолитровых ферментеров меняются многие параметры культивирования, в частности аэрация и перемешиваемость.

Для культивирования суспензий в производственных масштабах применяется аппаратура, разработанная для микробиологической промышленности, однако исследования последних лет показали, что растительные клетки в силу своих специфических особенностей требуют особых сосудов для культивирования. Клетки растений в десятки, сотни раз крупнее клеток бактерий и грибов, кроме того, их размеры меняются в процессе онтогенеза. Если в начале экспоненциальной фазы роста они мелкие и плотные, то в стационарной фазе роста они сильно увеличиваются в размерах и вакуолизируются. Чем крупнее становится клетка, тем больше возрастает опасность ее механического повреждения в процессе перемешивания. В то же время клетки растений, крупные и тяжелые, требуют эффективного перемешивания. Оседание их приводит к появлению «мертвых» зон в сосудах, в которых происходит быстрое накопление и старение клеток. Для культуры клеток женьшеня отрицательное влияние механического стресса при выращивании в ферментере с турбинными мешалками сказывалось на жизнеспособности клеток уже при скоростях мешалок свыше 100–350 об/мин, это отрицательно влияло на синтез ими антрахинонов. Устойчивость штамма к механическому стрессу является важным требованием к культуре и трудной задачей для исследователей.