Поводом для убийства послужила ссора двух царских приближенных, князя Дмитрия Ивановича Овчины-Оболенского и Федора Алексеевича Басманова. Это были молодые аристократы, успешно начинавшие свою карьеру: в разряде Полоцкого похода 1563 года они упоминаются в числе молодых дворян, которые должны были «за государем ездити». Хотя служба Федора Басманова и началась с участия в Полоцком походе, уже в то время царь особо выделял его из своего окружения. Он был послан известить о взятии Полоцка тетку царя Евфросинию Старицкую (с аналогичным поручением к брату царя Юрию в Москву был послан сам царский шурин, князь Михаил Темрюкович). Федор был сыном боярина Алексея Даниловича Басманова, в то время одного из ближайших советников царя, но его возвышение объяснялось, очевидно, интимной связью с Иваном IV. Указания на эту связь встречаются в ряде записок иностранцев, а прямой намек на нее виден в выпаде Курбского против советников, губящих тело и душу государя, «иже детьми своими паче Кроновых жрецов действуют».
Рассказ о ссоре и последовавших за ней событиях сохранился в записке польского шляхтича Войтеха (Альбрехта) Шлихтинга, выходца из видной дворянской фамилии великопольской шляхты. Он попал в русский плен после взятия русскими войсками крепости Озерище в ноябре 1564 года. Несколько лет он бедствовал, пока в 1568 году его не «выпросил себе в качестве слуги и переводчика» царский врач Арнольд Лензей. В конце 1570 года Шлихтингу удалось бежать из России. В Польше при дворе Сигизмунда II им было составлено «Краткое сказание о характере и жестоком правлении московского тирана Васильевича», которое должно было дискредитировать царя в глазах христианской Европы.
В «Сказании» Шлихтинг писал о царе, что тот «злоупотреблял любовью этого Федора, а он обычно подводил всех под гнев тирана». Очевидно, одним из таких лиц и оказался Дмитрий Овчина. Рассердившись на Федора Басманова, «Овчина попрекнул его нечестным деянием, которое тот обычно творил с тираном». Басманов пожаловался царю, тот пришел в ярость и, пригласив Овчину на пир, послал его в погреб выпить вина за свое здоровье, а там царские псари задушили князя.
На этот раз причастность царя к убийству была совершенно очевидна. «Пораженные жестокостью этого поступка, — читаем далее у Шлихтинга, — некоторые знатные лица и вместе верховный священнослужитель сочли нужным для себя вразумить тирана воздержаться от столь жестокого пролития крови своих подданных невинно без всякой причины и поступка».
Таким образом, действия царя столкнулись с протестом со стороны не только бояр, но и «верховного священнослужителя» — то есть митрополита.
Со второй половины 1563 года отношения царя с митрополичьей кафедрой серьезно осложнились. В «Пискаревском летописце» это ухудшение отношений отнесено к концу правления Макария. Однажды, повествует автор летописца, царь попросил у митрополита «душеполезной книги», а тот послал ему «погребален», то есть чин погребения. В ответ на слова разгневанного царя, что «в наши царские чертоги такие книги не вносятца», митрополит сказал, будто не знает более «душеполезной» книги: «аще хто ея со вниманием почитает, и тот во веки не согрешит».
Это полулегендарное свидетельство получает некоторое подтверждение в «Сказании о последних днях жизни митрополита Макария». Здесь читаем, что 3 декабря 1563 года святитель заявил о своем желании оставить кафедру и «отъити на молчалное житие» в Пафнутьев Боровский монастырь, где он некогда постригся в монахи. Настаивая на своем желании, он даже послал царю особое «писание». Царь с сыновьями посещал митрополита, упрашивая его «со слезами» остаться на престоле и «едва умоли его». Царь, очевидно, понимал, что уход Макария будет воспринят как публичное осуждение его политики, и стремился этого не допустить. Уговаривать Макария приезжала и царица Мария Темрюковна, которая, как видим, в отличие от Анастасии готова была активно поддерживать действия супруга. Лишь 21 декабря митрополит согласился на уговоры, и царь приказал «то писмо дранию предати пред его очима».
31 декабря 1563 года Макарий умер. Царь приложил усилия к тому, чтобы митрополичью кафедру занял человек, на которого он мог бы всецело положиться.
24 февраля 1564 года собор епископов избрал митрополитом старца Чудова монастыря Афанасия, бывшего протопопа Благовещенского собора Андрея, который в течение многих лет был духовником царя. Остался он им и после того, как постригся в 1562 году в Чудове монастыре с именем Афанасия. Здесь, в Чудове монастыре, в 1562—1563 годах он явно по заказу царя работал над составлением «Степенной книги». Афанасий, несомненно, принадлежал к числу наиболее близких к царю представителей духовенства. Как и царь, он был приверженцем сильной единоличной власти правителя. Однако, разделяя с царем его политические идеалы, митрополит не мог одобрить те методы, с помощью которых царь хотел реализовать их на практике.