1 января 1905 года великий князь перестал быть московским генерал-губернатором, а через месяц с небольшим грянуло возмездие. К смерти его приговорили наиболее радикальные представители российской оппозиции в отместку за Кровавое воскресенье, 9 января 1905 года, когда мирная манифестация была расстреляна войсками петербургского гарнизона.
Вот что писал один из свидетелей покушения на Сергея Александровича: «Без десяти минут в три... я взглянул в окно и увидел следующее. К Никольским воротам подъезжал на карете великий князь. а навстречу карете, но по тротуару шел какой-то человек с черными усами, одетый в суконную поддевку, черную шапку. На вид ему было лет около 30. Сначала он шел по тротуару, а потом при приближении кареты сошел на мостовую. Когда карета проехала мимо него, он быстро обернулся, выхватил из-под полы какой-то предмет, завернутый во что-то черное, и с силой бросил его в зад кареты. Блеснул огонь, в котором скрылась карета, послышался страшный, оглушительный удар, и я отлетел от окна вглубь комнаты сажени на четыре и упал на пол. Задребезжали и посыпались стекла. Когда я встал и подошел к окну, то мне представилась следующая картина.
Прямо против окна лежала какая-то груда. Снег был обрызган. Были разбросаны части рук великого князя и одна уцелевшая нога. Тут же лежала ось кареты и два колеса. Кучер, доехав до решетки, идущей от ворот до суда, здесь упал. Но потом поднялся, встал и оперся головой о решетку. В таком виде он был посажен, минут пять спустя, на извозчика и отвезен [в больницу]».
Кучер князя скончался от полученных ранений 7 февраля в Яузской больнице, перед смертью он рассказал следователю: «Отъехав от Николаевского дворца, я пустил лошадей крупной рысью. Проезжая по Сенатской площади, мы мало кого встречали. Я вез великого князя в генерал-губернаторский дом. Подъезжая к Никольским воротам, я направил лошадей немного левее считая от Николаевского дворца, чтобы быть как раз против ворот. Я видел, как стоявший на посту полицейский отдал великому князю честь. Вдруг, что-то точно разорвалось в воздухе, глаза мне закрыло облаком, и я почувствовал, что полетел вверх вместе с сиденьем. Боли я не чувствовал первое время никакой и не мог понять, что со мной происходит. Меня отнесло в сторону Окружного суда, и я крепко держался за решетку: мне представлялось, что я держу лошадей. Сиденье и передок кареты находились около меня.
Все это продолжалось несколько минут, а после у меня закружилась голова, и я стал терять сознание».
Вскоре после взрыва на Сенатскую площадь приехала супруга князя, великая княгиня Елизавета Федоровна, «встав на колени, она стала рыться в куче останков убитого князя, ощупывала руки, проводила по плечам, отыскивая голову». Собравшиеся на месте взрыва случайные прохожие пытались взять на память кто кусок шинели убитого, а некоторые -даже часть останков. По Москве пошла гулять острота: «Великий князь пораскинул мозгами».
В Санкт-Петербург, где в соборе Петропавловской крепости обычно хоронили Романовых, великого князя не повезли. Отпевали его в Алексиевской церкви Чудова монастыря, служивший панихиду митрополит Владимир назвал покойного мучеником (мог ли он предполагать, что это лишь начало мученичества Романовых). Николай II на прощание не приехал.
На месте гибели великого князя в апреле 1908 года установили памятный крест (автор В. М. Васнецов). А через десять лет крест был снесен по указанию Ленина. Сегодня крест воссоздан в Новоспасском монастыре. В память о своем убиенном супруге великая княгиня Елизавета Федоровна основала в Москве на Большой Ордынке Марфо-Мариинскую обитель, что было чрезвычайно высоко расценено современниками - как духовно-нравственный подвиг.
В советское время могила Сергея Александровича была утрачена, лишь в 1995 году, когда его останки обнаружились при раскопках в Кремле, они были перенесены в Новоспасский монастырь...