История этого собора тесно связана с царским родом Романовых: с царем Петром I (одобрил постройку и освящение в 1708 г. первого храма на этом месте), императрицами Анной Иоанновной (по ее велению начали в 1740 г. строительство третьего храма на этом месте), великим князем Иоанном VI Антоновичем (двоюродный внук и наследник императрицы Анны Иоанновны, младенец-император российский в 1740–1741 гг., в год его рождения каменный храм был заложен по указу императрицы, намеревавшейся назвать собор в его честь), Елизаветой Петровной (велела изменить проект третьего храма и строить не одноглавый, а пятиглавый храм по древнему российскому обычаю по образцу Успенского собора Московского Кремля, подарила собору древнее Берлинское Евангелие 1689 г., называемое с 1759 г. Елизаветинским), Екатериной II (благодаря ей с 1766 г. завершили строительство собора, освятили его Успенский придел в 1773 г., освятили собор в 1789 г.), императором Павлом I (часто молился в нем), императором Николаем I (по его указу 1845 г. храм стал собором Кавалеров Ордена Святого Князя Владимира), великим князем Владимиром Александровичем (1847–1909) и его женой великой княгиней Марией Павловной (1854–1920), которые особо почитали этот собор, были соответственно с 1896 г. и 1909 г. покровителями действовавшего при храме благотворительного общества.
Здесь, сменяя друг друга, поочередно были возведены три храма. Первый, деревянный, освятили в 1708 г. во имя Успения Пресвятой Богородицы, в народе его называли храм на Мокруше, потому что он находился в одном из самых низких и затопляемых мест города. Второй, мазанковый, храм построили в 1712–1719 гг. и вскоре назвали собором. Этот собор в народе называли Успение-на-Мокруше, или по приделу – собор Николы Мокрого, из-за того, что это место часто затоплялось невскими водами. В 1740 г. императрица Анна Иоанновна повелела построить третий храм, уже каменный собор, который она наметила посвятить святому Иоанну Златоусту, имя которого носили ее отец царь Иван Алексеевич (по отцу брат Петра I, с которым он официально правил совместно, на деле правил один Петр) и ее двоюродный внук и наследник Иван VI Антонович; этот храм создавали арх. М.Г. Земцов и П.А. Трезини. С 1747 г. возобновили строительство храма, но уже строили его в соответствии с желанием императрицы Елизаветы Петровны иметь здесь пятиглавый (как древние русские храмы) Успенский собор и колокольню. Но завершили строительство собора только при активном внимании к этому императрицы Екатерины II, выбравшей в 1766 г. простой, красивый и относительно дешевый проект завершения собора архитектора А. Ринальди. Полное завершение строительства собора осуществляли с 1783 г. архитекторы М. Мелентьев и И.Е. Старов. В 1789 г., при Екатерине II, освятили новый собор с посвящением во имя святого равноапостольного князя Владимира. При соборе действовали: с 1806 г. Князь-Владимирское Духовное училище (одно из четырех имевшихся тогда в местной епархии), благотворительное общество (с 1875 г.), приходской приют для сирот и бедных детей (где их воспитывали и обучали разным ремеслам), церковно-приходская школа (с 1902 г.).
С 1922 г. в соборе хозяйничали «обновленцы», активно сотрудничавшие в советский период с карательными органами. Собор закрыли в 1926 г. Регулярные службы в храме возобновились в 1928 г., в 1938–1941 гг. собор был кафедральным. С 1940 г. до 2001 г. в соборе находилась одна из главных святынь города – почитаемая чудотворной Казанская икона Божией Матери. Даже в период блокады ежедневные службы в соборе не прекращались. Служивший тогда в соборе протоиерей Николай Ломакин позже был единственным представителем Русской православной церкви на Нюрнбергском процессе.
В наши дни главными святынями собора являются образ Успения Божией Матери из подворья Киево-Печерской лавры в Санкт-Петербурге (список с чудотворной Успенской иконы), икона Святого благоверного князя Александра Невского, икона Покрова Пресвятой Богородицы (1898), чтимые иконы Божией Матери «Знамение», «Страстная», Иверская, «Всех Скорбящих Радость», а также три образа Святителя Николая, Трех Святителей, Благовещения, преподобного Серафима Саровского (привезен с торжеств 1903 г., когда происходила его канонизация), святой Екатерины, три образа святого Владимира. В соборе с 1759 г. сохраняется «Елизаветинское» Евангелие.
Собор является ценным архитектурно-художественным памятником. Стиль храма – переходный от барокко к классицизму. Это собор-базилика, плану собора придана форма равноконечного креста. Над алтарной частью возвышается пятиглавие. Всех восхищает высокая (более 57 м, на колокольне висят 7 колоколов, из которых самый большой, отлитый в 1779 г., весит 5 т) стройная трехъярусная колокольня. Собор рассчитан на 3000 верующих. В соборе пребывает много древних икон.