Магистры ордена никогда не отказывались от Пруссии и неустанно просили у императора помощи, чтобы возвратить свои владения. Магистр Кронберг умер, у ордена не осталось ни малейшей надежды добиться справедливости. Его преемник не хотел сдаваться и заручился обещаниями Карла V. Письма инвеституры, полученные императором на следующий день после избрания великого магистра, подтверждали обоснованность требований тевтонских рыцарей: действительно, император приказал всем принцам империи оказывать помощь магистру в возвращении имущества ордена, отобранного герцогом Пруссии. Но на самом деле проблема была не только делом немцев, она касалась также Польши, так как с 1525 г. герцогство Пруссии стало вотчиной Короны. Отказался принимать свершившийся факт и магистр Георг фон Венкхайм (1566-1572), а также все его преемники.
Но Пруссия и Ливония не были единственными провинциями, подчиненными Тевтонскому ордену, которые примкнули к Реформации. Многочисленные немецкие княжества стали протестантскими, а в этом случае сохранять на их территории религиозный орден, верный Риму, не имело смысла. Принцы, вельможи, городские власти, примкнувшие к Реформации, проявляли большой интерес к имуществу Церкви и религиозных орденов. Протестантская Реформации восторжествовала в Саксонии, Тюрингии, Гессене, Голландии, т. е. в тех регионах, где Тевтонский орден имел значительные владения. В этих регионах одна часть братьев ордена, в основном рыцари, перевели имущество из церковного владения в светское, другая часть, в основном братья-священники, оставшиеся верными Риму, была изгнана. Рыцари, присоединившись к Реформации, считали возможным оставаться членами Тевтонского ордена. Это создавало запутанное юридическое положение, а именно: существование внутри Тевтонского ордена рыцарей-протестантов, не признанных Римом, но которых терпел великий магистр. Что и произошло в Саксонии. Зато в Тюрингии ландграф приступил к секуляризации всех командорств, принадлежащих ордену, подражая в этом другим протестантским сеньорам; в то же время он позволил существовать вотчине в Тюрингии и признал за магистром право назначать командора, лишь бы тот был протестантом. В Гессене сосуществовали тевтонские рыцари-протестанты и католики, представленные, независимо от их вероисповедания, в генеральном капитуле и принимающие участие в решении вопросов, касающихся ордена.
В Утрехте проблем почти не было вплоть до правления Филиппа II, но победа Реформации на севере Нидерландов привела к образованию нового протестантского государства — Объединенные Провинции Нидерландов. Великий командор Утрехта, Франц фон Лоэ, примкнул к Реформе в 1579 г., но его преемники-католики попытались сохранить орден в Голландии.
В 1615 г. правитель Утрехта сообщил великому командору Тьерри де Блуа, что тот должен выбрать помощника из числа протестантов. Тевтонские рыцари Утрехта отказались подчиниться этому требованию и после смерти великого командора избрали командором католика, Гаспара ван Линдена, который стал последним католическим командором Утрехта. В 1520 г. после смерти Гаспара ван Линдена правитель Утрехта назначил протестантского герцога Генриха фон Нассау великим командором; большая часть рыцарей приняла протестантство, Утрехт сохранил традиции ордена, но под протестантским знаменем.
В Священной империи, где католические и протестантские принцы сумели без вражды найти разумный компромисс, благодаря Аугсбургскому миру, положение Тевтонского ордена как на католических землях, так и на протестантских оказалось весьма неопределенным. Созданный, чтобы заботиться о раненых и больных в крестовых походах, а уже во вторую очередь чтобы принимать участие в войнах, которые вел христианский мир против неверных и язычников, Тевтонский орден, изгнанный из Святой земли сарацинами, а из Пруссии — протестантской ересью в раздробленную и ослабленную немецкую землю, был обречен на исчезновение. Количество братьев-рыцарей и братьев-священников постоянно сокращалось; множество командорств держалось ничтожно малым количеством рыцарей или было оставлено ими. Многие спрашивали друг друга, сохранилась ли у ордена та роль, которую ему надлежало играть в этом государстве на немецкой земле, последнем убежище тевтонских рыцарей, христиан, отныне воюющих с другими христианами. Кому нужен орден монахов-воинов?
В тот самый момент, когда Священная империя пыталась справиться с кризисом, спровоцированным учением Лютера, возникла новая опасность — на Востоке. После поражения короля Богемии и Венгрии Людовика II (Лайоша) в Мохаче 25 августа 1526 г. оттоманские турки заняли Венгрию, что создавало реальную угрозу для Священной империи, так как, с одной стороны, Венгрия граничила с австрийскими провинциям империи, а с другой стороны, потому, что член императорской семьи Фердинанд Габсбургский стал королем Венгрии.