Жизнь замечательных устройств

Ещё одна проблема, путей решения которой Мартон не видел — как бороться с неизбежным испарением воды из биологического образца в условиях разрежения рабочей камеры электронного микроскопа и связанным с этим испарением изменением форм изучаемых белков и нуклеиновых кислот. Невооружённым глазом было видно и другие проблемы — биологические объекты могли отличаться крайне низкой контрастностью изображения при прохождении через них электронов с высокой энергией; энергию электронного пучка нельзя было делать очень высокой для предотвращения повреждения образца уже на химическом уровне организации; для предотвращения вторичного рассеивания электронов образцы должны были быть не просто тонкими, а представляющими собой идеальный монослой, состоящий из изучаемых объектов. Также было очевидно, что для записи изображений нужно использовать быстрые детекторы — изучаемые биомолекулы могли менять свою форму или даже перемещаться из-за незначительного дрейфа температуры или взаимодействия с бомбардирующими их электронами.

Необходимость изучать низкоконтрастные биологические материалы с использованием электронов, обладающих как можно меньшей энергией, стимулировала разработку новых подходов к приготовлению и подготовке биологических материалов для анализа. Первым методом, применение которого позволило значительно увеличить качество получаемого изображения, был метод негативного контрастирования, разработанный в 1940-х годах и модифицировавшийся следующие два десятка лет после изобретения (J. Applied Physics, 1945, 16, 459–465 DOI: 10.1063/1.1707615; J. Mol. Biol., 1965, 11, 403–423; DOI: 10.1016/S0006-3495(89)82799-7).

Метод негативного контрастирования основан на том, что биологический материал внедряют в тонкую аморфную плёнку соли тяжелого металла (например, фосфата вольфрама), формирующую определенный шаблон вокруг биомолекул. Полученный шаблон рассеивает электроны эффективнее инкапсулированного в него биологического материала, он более устойчив по отношению к повреждению потоком электронов и не дает биологическим молекулам менять форму во время их сушки в вакууме в камере электронного микроскопа.

Негативное контрастирование образцов позволило получать детальную информацию о строении бактерий, вирусов и клеточных органоидов. Однако, при уменьшении масштаба, например, при попытке изучить положение молекул в молекулярных комплексах, можно получить, в лучшем случае, только изображение «конверта», в который помещались биомолекулы; разрешение этого изображения ограничивалось величиной зерна шаблона. Несмотря на изъяны, такой метод подготовки пробы позволил исследователям получить информацию о структуре ряда соединений, правда, в низком разрешении. Разработанные в то время экспериментальные и теоретические подходы, применявшиеся для получения информации о трехмерной структуре объекта с помощью суммирования его двумерных проекций, полученных с помощью электронного микроскопа, заложили основы криоэлектронной микроскопии.

Улучшения в методы исследования биологических объектов с помощью электронной микроскопии внёс в том числе и Аарон Клуг, получивший в 1982 году Нобелевскую премию по химии «…за разработку метода кристаллографической электронной микроскопии и прояснение структуры биологически важных комплексов нуклеиновая кислота — белок…». Он одним из первых пришел к тому, что для уточнения трехмерной структуры объекта, полученного с помощью метода негативного контрастирования, необходимо получать двумерные проекции с различных направлений, что можно организовать, изменяя угол, под которым на образец направляется поток электронов, или проводя анализ большого количества частиц, ориентированных различным образом. В 1960-х годах Клуг применил свои подходы, с помощью электронного микроскопа изучив тонкие кристаллы каталазы (Berichte der Bunsengesellschaft für physikalische Chemie, 1970, 74, 1129–1137; DOI: 10.1002/bbpc.19700741109

).

В 1968 году Клуг совместно с Давидом ДеРозье сообщили о первом удачном примере вычисления трехмерной модели биологического объекта на основании информации о двумерных проекциях, полученных с помощью электронного микроскопа. Исследователи изучили хвост бактериофага T4, он был выбран в качестве объекта исследования благодаря своей спиралевидной симметрии. Для него трехмерную модель можно было построить, анализируя лишь одну двумерную проекцию, которая давала ровно такую же информацию, которую можно было получить, анализируя хвост вируса под другими углами (Nature, 1968, 217, 130–134; DOI:10.1038/217130a0).