Пеньковский застал окончание Великой Отечественной войны. Он служил сначала адъютантом командующего артиллерией 1-го Украинского фронта генерала С. С. Варенцова, а затем командиром гвардейского артиллерийского полка того же фронта. Во время службы между начальником и подчиненным сложились дружеские, доверительные отношения, которые в середине 1950-х годов помогли Пеньковскому устроиться на работу в Военную академию имени Ф. Э. Дзержинского. Через несколько лет шпионское дело Пеньковского серьезно подорвет репутацию Варенцова, и, хотя генерал оказывал поддержку Пеньковскому задолго до вербовки последнего иностранными спецслужбами, Варенцова снимут с постов, понизят в звании (с главного маршала артиллерии до генерал-майора) и лишат звания Героя Советского Союза.
К середине 1950-х годов Пеньковский был уже сотрудником Главного разведывательного управления Генерального штаба Вооруженных Сил СССР. В 1955 году его впервые направили в зарубежную командировку в Турцию, где в течение нескольких месяцев он вел разведывательную работу в должности помощника военного атташе при советском посольстве. Служба в Турции закончилась провалом. По одной из версий, он начал слишком активно предлагать иностранным дипломатам советские военные секреты, чем вызвал смятение и подозрения.
На короткое время его уволили со службы в ГРУ, но в 1957 году взяли обратно в обход решения начальника ГРУ И. А. Серова. В одной из последующих зарубежных командировок Пеньковский познакомился с женой и дочерью Серова, навязался к ним на прогулку и по прибытии в Москву явился в гости с подарками. Впоследствии это «знакомство» сослужило начальнику ГРУ плохую службу.
Агентурную работу Пеньковский вел под прикрытием Государственного Комитета Совета Министров СССР по координации научно-исследовательских работ. Его устроили в Управление внешних сношений Комитета, которое занималось научно-техническим сотрудничеством с другими государствами и международными организациями. Целью его деятельности в Комитете стала разработка и вербовка иностранных агентов, а также сбор иностранных технологических секретов для их использования в советской военной промышленности. На одной из встреч с иностранными бизнесменами, организованной Комитетом, Пеньковский познакомился с Гревиллом Винном, ставшим впоследствии основным получателем собранных Пеньковским секретных данных.
Вербовка советского агента западными спецслужбами произошла во время его первой командировки в Лондон в апреле 1961 года. Гревилл Винн свел его с представителями английской и американской разведок. В ходе первой встречи в лондонском отеле «Маунт Ройял» его познакомили с условиями агентурной работы. Во время следующих встреч в той же гостинице ему передали фотокамеру для изготовления микропленок и объяснили правила фотографирования и передачи собранной информации. Связующим звеном для передачи агентурных данных определили Винна, периодически бывавшего в Советском Союзе под видом организатора или участника международных выставок.
Ценные сведения о советских спецслужбах Пеньковский начал давать на первой же встрече. Ему представили несколько тысяч фотографий, на которых он опознал несколько сотен сотрудников КГБ и ГРУ. Пеньковский сам выступил с инициативой стать информатором иностранных разведок. Типичные для вербовки случаи подкупа и устрашения компроматом к нему не применялись. Ему обещали гражданство, высокую должность в разведке США или Великобритании, защиту от возмездия со стороны советских спецслужб.
Во время второй поездки в Лондон в июле — августе 1961 года Пеньковский, будучи уже двойным агентом, передал микропленки с отснятыми секретными данными и познакомился с запасным посредником, которому следовало передавать материалы в отсутствие Винна в Москве. Им стала Дженет Чизхолм, жена британского дипломата в СССР, и агента британской разведки Ролангера Чизхолма. Пеньковского ознакомили с принципами работы на радиоустройстве для передачи агентурных данных.
Среди английских и американских агентов, работавших с Пеньковским, постепенно наметился раскол. Одни, несмотря на одержимость Пеньковского обещанными роскошью, титулами и званиями, считали его сведения ценными и достоверными. Другие полагали, что Пеньковский не просто врет и вводит их в заблуждение, но является опасным агентом КГБ, внедренным в западные спецслужбы с целью их дезинформации. Призывы второй группы проверить советского агента на детекторе лжи не встретили поддержки — Пеньковский испытывал неизменное недоверие к подобной технике, что ставило под угрозу дальнейшую конспиративную работу.