Накануне дня суда Желябов подал заявление о своем несогласии с компетенцией Особого присутствия Сената. В заявлении он указал, что действия подсудимых «направлены исключительно против правительства», что «правительство, как сторона пострадавшая, должно быть признано заинтересованной в этом деле стороной и не может быть судьей в своем собственном деле». Подчеркивая неподсудность дела Особому присутствию, Желябов признавал единственной судьей в этом деле «весь русский народ чрез непосредственное голосование» или «в лице своих законных представителей в Учредительном собрании». Однако, признавая неосуществимость такой формы суда, он требовал рассмотрения дела судом присяжных, будучи «в глубокой уверенности, что суд общественной совести не только вынесет нам оправдательный приговор, как Вере Засулич, но и выразит нам признательность отечества за деятельность особенно полезную».
К слову сказать, такое требование не соответствовало действовавшему тогда законодательству. В компетенцию суда присяжных изначально не входили дела о государственных преступлениях, в том числе преступлениях против Особы Государя Императора. Поэтому заявление Желябова осталось без внимания.
Судебный процесс начался 26 марта (7 апреля) в 11 часов утра под председательством первоприсутствующего Особого присутствия Сената Э. Я. Фукса. Обвинение в процессе поддерживал исполняющий обязанности прокурора Санкт-Петербургской судебной палаты Н. В. Муравьев. Все шестеро «первомартовцев» обвинялись во вступлении в тайное общество, которое, как указано в обвинительном акте, имело цель
Кроме того, Желябов был обвинен в организации покушения на царя 18 (30) ноября 1879 года, когда он на пути следования царского состава близ города Александровск заложил под железнодорожное полотно мину и не сумел осуществить покушение только из-за неисправности бомбы. Кибальчич также обвинялся в приготовлении покушения под Александровском и на Одесской железной дороге: он доставил Желябову необходимую для совершения взрыва спираль Румкорфа (индукционную катушку) и хранил в своей квартире материалы и отдельные части для производства бомб. Перовская дополнительно обвинялась в подготовке нападения, случившегося день спустя после событий под Александровском, когда заложенная в подкоп мина взорвалась под свитским поездом царского состава. Михайлов также обвинялся в оказании вооруженного сопротивления при задержании.
Защиту представляли видные присяжные поверенные (адвокаты) того времени: Е. И. Кедрин (Перовская), В. Н. Герард (Кибальчич), К. Ф. Хартулари (Михайлов), А. М. Унковский (Рысаков) и А. А. Герке (Гельфман). Желябов от адвоката отказался. Тактика защиты сводилась к тому, чтобы акцентировать внимание суда на смерти непосредственного убийцы императора и тем самым освободить своих подзащитных от подозрений в цареубийстве. Дополнительным аргументом в защиту Рысакова называлось его несовершеннолетие (на момент преступления ему было 19 лет, в то время как совершеннолетие считалось при достижении 21 года). Также особым подходом отличалась судебная защита Михайлова и Гельфман. Вывод об их вовлеченности в террористическую деятельность «Народной воли» основывался на показаниях Рысакова и косвенных свидетельствах, что могло породить у суда сомнения в достаточности собранных против них доказательств.
Все подсудимые, за исключением Рысакова, подтвердили свое участие в социал-революционной партии «Народная воля». Рысаков же это отрицал, указывая на свою приверженность скорее партии «Черный передел», которая, как и «Народная воля», образовалась после распада «Земли и воли», но, в отличие от народовольцев, не имела ярко выраженной террористической направленности. Так он пытался оградить себя от негативных последствий решения о причастности его к противозаконной деятельности «Народной воли». При этом, рассчитывая на смягчение наказания, Рысаков в ходе судебного процесса подтвердил данные им на следствии показания, в которых он изобличал других подсудимых в прямом или косвенном участии в событиях 1 марта 1881 года.