Работать Дмитрия направляют в Одессу преподавателем математики, физики и естественных наук в гимназию при Ришельевском лицее. В 1856 году Менделеев возвращается из Одессы и защищает магистерскую диссертацию по химии «Удельные объемы». После того как Дмитрий стал магистром, он получил должность приват-доцента и начал читать лекции по органической химии. Зарекомендовав себя как талантливого преподавателя и ученого, он отправляется в двухгодичную командировку в Германию, где у него появляется возможность работать в собственной частной лаборатории. Там ему удалось установить, что жидкость переходит в пар при определенной температуре, которую он назвал «абсолютной температурой кипения». Это крупное научное открытие Менделеева, давшее толчок для исследований других ученых. Приехав в Россию в 1861 году, Менделеев издает учебное пособие «Органическая химия», которая впоследствии удостоилась Демидовской премии Петербургской академии наук.
В 1863 году физико-математический факультет Петербургского университета выдвигает его кандидатуру на должность профессора на кафедру технологии, но министерство не утверждает данное предложение. А в 1864 году его избирают профессором химии Технологического института. В то время он трудится в сфере изучения нефтедобычи – разработки имели большое значение для российской промышленности. А в 1865 состоялась защита докторской диссертации «О соединении спирта с водой». В 1867 году он получил в университете кафедру неорганической химии, на которой он и пробудет 23 года, и здесь же приступит к написанию труда «Основы химии». Эта книга далека от стандартного учебника по химии, скорее фундаментальное сочинение, в котором содержатся вся философия и фактические материалы химической науки. Только при жизни ученого ее переиздавали восемь раз в России, кроме того, получила издание во Франции, Германии и трижды в Англии. Про свой труд Менделеев писал: «Эти “Основы„– любимое дитя мое. В них мой образ, и мой опыт педагога, и мои задушевные научные мысли. В “Основы химии„вложены мои духовные силы и мое наследство детям».
В 1869 году Менделеев совершил свое главное открытие, которое вписало его имя в историю науки, – периодический закон химических элементов. Существует достаточное количество версий того, как же это произошло. Но сам Менделеев рассказывал так: «Я стал подбирать, написав на отдельные карточки элементы с их атомными весами и коренными свойствами, что быстро и привело меня к тому заключению, что свойства элементов стоят в периодической зависимости от их атомного веса». Ученый был уверен, что закономерность существует, и знал, где ее искать. Менделеев пришел к выводу, что элементы по возрастанию их атомных масс выказывают явную периодичность физических и химических свойств. И вот вечером 1 марта (17 февраля по старому стилю) 1869 года он начисто переписал составленную им таблицу и послал ее в типографию, назвав «Опыт системы элементов, основанной на их атомном весе и химическом сходстве». Дата стала знаменательной, так как вошла в историю как день рождения периодического закона. Открытие Менделеева дало возможность посмотреть по-новому на изучение известных химических элементов, скорректировать атомные веса, а также предсказать существование и свойства 11 не открытых еще элементов. Менделеев даже указал, каким путем можно их открыть, что и было сделано с течением времени. Сначала к системе Менделеева отнеслись скептически, но открытие новых элементов оказалось величайшим триумфом Периодического закона.
Он сделает еще ряд открытий вплоть до 1874 года и сконструирует пикнометр – прибор для определения плотности жидкости. В 1876 году Менделеева изберут членом-корреспондентом Петербургской академии наук.
В 1881 году Дмитрий Менделеев предложил братьям Нобелям из тяжелых остатков нефтепереработки делать смазочные масла. Они идею не поддержали, зато другой нефтепромышленник, В. Рогозин, сделал на ней значительную часть своего состояния. Данные масла широко продавались и в России, и за рубежом. Их качество высоко оценивалось на международных выставках. Потом Рогозин, опять-таки основываясь на открытиях Менделеева, начал промышленный выпуск бензола, толуола, ксилола и антрацена. К слову, завод, где производились эти жидкости, действует и сейчас – Ярославский опытно-промышленный нефтемаслозавод имени Д.И. Менделеева.