История собора тесно связана с жизнью и деятельностью членов рода Романовых. Особенно способствовали строительству и украшению храма императрицы Елизавета Петровна, а также Екатерина II (присутствовала на освящении собора в 1762 г., подарила собору 10 богато украшенных икон с изображением святых, в дни памяти которых русский флот одержал победы над шведами и турками в 1770–1790 гг.) и ее муж – император Петр III, они были ктиторами собора, в котором было устроено царское место, а также великий князь Константин Николаевич (1827–1892 гг., генерал-адмирал, с 1855 г. управлял флотом и морским ведомством на правах министра, сделал исключительно много для развития морского флота России) и великий князь Александр Михайлович (1866–1933 гг., адмирал, сделал ряд дельных предложений по совершенствованию военно-морского флота России, с 1900 г. руководил делами торгового мореплавания, в 1902–1905 гг. выполнял обязанности главноуправляющего на правах министра управления торговым мореплаванием и портами).
В соборе проводились торжественные богослужения, связанные с закладкой новых кораблей, спуском их на воду, отправлением в дальнее плавание или с возвращением из плавания. Здесь служили торжественные молебны в память о победах русского флота при Чесме (1770), Наварине (1827), Синопе (1853 г., последнее сражение эпохи парусного флота) и др., служили панихиды по погибшим морякам в Цусимском (1905) и других морских сражениях. До 1917 г. собор был постоянным местом поминовения погибших моряков в Чесменской битве и Цусимском сражении. Собор никогда не закрывался, но после переворота 1917 г. из него были изъяты многие его богатства. В советский период и до 2000 г. в соборе была кафедра Санкт-Петербургских владык (затем ее переместили в Казанский собор). В наши дни в соборе восстановлена традиция служить панихиды по погибшим морякам и подводникам. На стенах храма укреплены таблички с именами принявших смерть в морской пучине. В соборе проходят торжественные акты посвящения в офицеры.
В соборе сохранилось много старых чтимых икон. Главными святынями храма являются икона святителя Николая Чудотворца с частицей мощей этого святого (икону подарили в XVIII в. матросы-греки, частицу мощей подарил в 1944 г. митрополит Илия Салиби – один из иерархов Антиохийской церкви в знак восхищения и уважения ленинградцев, вынесших 900 дней блокады), а также рака с частицей святых мощей святителя Феодосия Черниговского. Особо почитаемыми являются иконы Божией Матери – Троеручницы из Симеоновской церкви, «Всех Скорбящих Радость», Тихвинская, Казанская, «Неопалимая купина».
Главной иконой Николо-Богоявленского собора и одной из величайших святынь Петербурга является особо чтимый образ святителя Николая Чудотворца с частицей его мощей.