Мария отправилась в путь из Кале с сердцем, полным грустных предчувствий и сожалений, которые выразились в дошедших до нас прекрасных стихах. Королева высадилась в Лейте, а оттуда поехала в Голируд, где не было сделано никаких приготовлений к её прибытию. В распоряжении Марии не имелось никаких военных сил, и, когда её дядья возвратились во Францию, она осталась одна среди полуварварского народа, язык которого она не могла считать родным и религиозные верования которого не разделяла. После двенадцатилетнего отсутствия королевство Шотландское показалось ей чужбиной, а явное недовольство подданных и их враждебные демонстрации доказали ей, что она навсегда утратила право на народную любовь. Яростный и непримиримый проповедник кальвинизма Джон Нокс вместо приветственной речи встретил Марию изданием в свет жёсткого памфлета «Первый звук трубный против чудовищного управления царства женщинами», где называл свою королеву новой Иезавелью. Через неделю после приезда Мария пожелала отслужить в дворцовой часовне благодарственный молебен по чину римско-католической церкви. Узнав об этом, разъярённая толпа прервала богослужение и едва не умертвила королевского духовника.
Злобная клевета с самого начала окружала имя королевы. Действительно, она была молода, красива и даже не пыталась играть роль безутешной вдовы. Сперва Марию обвиняли в преступной связи с французским кавалером Данвиллем. Затем произошла скандальная история с другим французским дворянином - поэтом Шателаром. Безуспешно добиваясь любви Марии, он в 1563 году тайком проник в её спальню, был схвачен стражей, обвинён в оскорблении величества и обезглавлен. Хотя в этой истории королева оказалась скорее жертвой, чем соблазнительницей, в глазах суровых пуритан её роль всё равно была очень неблаговидна. Во избежание лишних кривотолков Мария принуждена была подумать о замужестве и выбрала себе в супруги лорда Дарнлея, представителя одной из самых знатных шотландских фамилий. Брак с ним должен был укрепить положение королевы. Но не один только политический расчёт двигал Марией Стюарт, она испытывала к своему избраннику и сердечное влечение. В июле 1565 года состоялось бракосочетание королевы, а вслед за тем началась война с протестантскими лордами. Королева собрала несколько отрядов регулярной армии, верных вассалов и двинулась из Глазго против мятежников. Те не осмелились начать сражение и отступили на английскую территорию. Уже во время этих событий возникли разлады между Марией и её мужем. По свидетельству современников, Дарнлей имел грубые привычки и находил удовольствие только в буйных развлечениях, на охоте и в пирах. В довершение он был человек наглый, бесхарактерный и чуждый всяких интересов образованного общества. Вскоре он стал требовать для себя не только королевского титула, но и всех королевских прав. Хотя Мария в первое время страстно любила своего мужа, она не была так ослеплена, чтобы дать Дарнлею равное себе положение. Тогда он озлобился и вступил в тайную связь с её врагами. Был составлен заговор, главной жертвой которого сделался секретарь Марии Давида Риччо. Королева отличала его своим вниманием, и потому был пущен слух, что он находится с ней в любовной связи. В марте 1566 года заговорщики ворвались в покои королевы и убили Риччо почти что на её глазах. Дарнлей не скрывал своей связи с убийцами. С этого времени отношения между супругами ухудшаться. Родив сына, Мария стала откровенно тяготиться своим браком. В официальных документах имя Дарнлея с первого места переместилось на второе, причём его именовали уже не королём, а только супругом королевы. В конце концов он сделался так ненавистен Марии, что она обратилась за помощью к своим вельможам, умоляла избавить её от опостылевшего мужа, но при этом объявила, что не может одобрить никакого способа, несогласного с требованиями её совести и чести. Лорды дали ей обещание действовать по законам чести. Но между собой заключили форменный договор об убийстве короля. Несмотря на все старания защитников Марии оправдать её дальнейшие действия, они выглядят очень подозрительно. В конце 1566 года королева сделалась вдруг очень нежна к мужу, помирилась с ним и в январе 1567 года перевезла Дарнлея в Эдинбург. Вследствие болезни короля его поселили в отдельном доме за городской стеной. Мария часто навещала его там. Между тем заговорщики подвели под дом мину и ночью 9 февраля взорвали несчастного вместе со всей его прислугой.