Франциск I, герой состоявшейся в 1515 году битвы при Мариньяно (городе, расположенном к югу от Милана) и заклятый враг Карла, был повержен. Те, кто рассчитывал, что Карл будет плясать от радости, оказались разочарованы. Император спокойно выслушал весть о своей победе, поражении французов и гибели большей части армии, а затем удалился в часовню для молитвы. После молитвы он сказал то, что и подобало сказать императору: «Давайте поблагодарим Бога за эту победу. Народ должен праздновать ее, как и я, в церкви. Не следует ликовать на улицах, устраивать празднества и фейерверки и играть музыку, ибо за эту победу пролита христианская кровь
Но, как и Франциск I, император не доверял английскому посреднику, поскольку тот в прошлом уже продемонстрировал, что в любой момент способен снова перейти на сторону французов.
Постоянные войны, которые Карл вел в последние десять лет, и избирательная кампания в борьбе за императорскую корону обошлись ему в целое состояние. Казна была пуста, в Германском королевстве началось народное восстание, а в Нидерландах то и дело возникали проблемы, связанные с протестантами. Карл решил связать Франции руки, отобрав часть ее земель в пользу Священной Римской империи. Он выставил французскому королю жесткие требования. Франциск I должен был финансировать новый крестовый поход. Карл также потребовал от французского короля вернуть фельдмаршалу Шарлю III де Бурбону конфискованные у него земли.
При этом император Священной Римской империи сохранял свои права на герцогство Бургундское, Милан и Неаполь и требовал от французского короля отказаться от сюзеренитета над Артуа и Фландрией. Переговоры длились несколько месяцев, в течение которых здоровье французского короля стремительно ухудшалось. Карл начал опасаться, что после смерти заложника он останется с пустыми руками. Он решил, что синица в руках лучше, чем журавль в небе. В январе 1526 года в Мадриде было заключено соглашение, по которому Карл получал контроль над герцогством Бургундским. Франция также отказалась от всех прав на Милан и Неаполь и вернула Шарлю III де Бурбону конфискованные у него владения. Но сестра Карла Элеонора теперь должна была стать женой французского короля, что позволило бы императору получить новую роль во французской династии и вынудило бы Шарля III де Бурбона искать себе новую невесту.
Французский король получил свободу, но при этом был вынужден отдать своих двоих сыновей в заложники как минимум до вступления в силу нового соглашения. Обмен принцев на их отца состоялся 17 марта 1526 года на острове посреди реки Бидасоа, у границы между Францией и Испанией. Все свидетельствовало об окончательном поражении Франциска I.
Но хитроумному лису Франциску I не понадобилось много времени, чтобы все уладить. Сразу после возвращения домой Франциск I аннулировал Мадридский договор, который, как он утверждал, его принудили подписать. Преемник злополучного Адриана ван Утрехта папа Климент VII в это время основал Коньякскую лигу, объединившую Венецию, Милан, Флоренцию, Геную и Францию для того, чтобы изгнать Карла из Италии.
Началась очередная война за Италию, и Шарль III де Бурбон, продолжавший состоять на службе у Карла, двинулся на Рим, возглавив армию из 20 000 испанских солдат и немецких ландскнехтов.
Солдатам месяцами не платили жалованья. Герцог Бурбон сумел успокоить испанских солдат и немецких ландскнехтов лишь обещанием большой добычи в случае завоевания Рима. 6 мая 1527 года имперская армия стояла у ворот Рима, с нетерпением ожидая штурма. Герцог Бурбон в честь этого события облачился в белые доспехи и на фоне солдат выглядел белой вороной. Во время штурма его застрелили первым.
Флорентийский художник Бенвенуто Челлини позже утверждал, что именно он выпустил роковую пулю в герцога Бурбона. Другие источники, напротив, утверждали, что фельдмаршал слишком поспешно взобрался на штурмовую лестницу и упал с нее. Тысячи солдат, которым удалось невредимыми прорваться за городские стены, устроили в Риме резню.
Папа римский бежал из Рима через тайный подземный ход, позволив войскам Карла пройти по городу подобно тарану и разграбить дома и церкви. В последующие дни монахини и девушки подверглись изнасилованию, после чего были заперты в борделях. Маленьких детей выбрасывали из окон на улицы, а немецкие ландскнехты приказали одному священнику причастить облаткой осла. За отказ это сделать священник был убит.
Захватчики вскрывали склепы, не пожалев гробницу Юлия II, и играли черепами в футбол, а мощи выбрасывали на улицу или продавали в трактирах. Всего жаждущие кровопролития солдаты убили около 10 000 жителей.