Иностранные послы сообщали о «взаимной ненависти и недоверии» придворных группировок. Реформы в армии, привлечение на службу иностранцев, устройство академии, открытие идеологом нового правительства Сильвестром Медведевым латинской гимназии вызывали неудовольствие Церкви. Иоаким осуждал правительницу за то, что она осмелилась принять шведских послов, и оказывал двору Петра I материальную поддержку; Голицын конфликтовал с Милославскими, противники князя не одобряли его покровительство иезуитам и распускали слух о его подкупе шведами. Безуспешные Крымские походы подорвали авторитет временщика в армии, тем не менее царевна за первый поход наградила князя золотой медалью, осыпанной драгоценными камнями (рядовым ратникам досталось по серебряной копейке), а за второй — особой «похвальной грамотой», «золотным кафтаном» на соболях, серебряным кубком и крестьянской волостью в Суздальском уезде.
В 1689 году Шакловитый начал агитировать стрелецких командиров подать челобитную о венчании правительницы на царство. Предложение не получило поддержки, и царевна «того дела делать не указала». В том же году в России и за границей стал распространяться коронационный портрет Софьи — в царском облачении и со скипетром, а в Москве Шакловитый вновь собирал стрельцов, чтобы организовать её «выборы» на царство по образцу 1682 года.
На этих совещаниях, если верить показаниям стрельцов на следствии, зашла речь о том, чтобы «уходить медведицу, царицу Наталью» и самого Петра: «Чего и ему спускать? За чем стало?» Были предложения подложить царю в сани гранату или зарезать его во время пожара. Возражений, судя по материалам следствия, вроде бы не последовало, как, впрочем, и каких-либо решительных действий. По-видимому, стрельцы не доверяли царевне и не желали уничтожать сторонников Петра без официального приказа. Отдать же его Софья так и не решилась, тем более что в рядах её приверженцев не было единства — например, Сильвестр Медведев выступал против покушения на вождей конкурирующей «партии» Б. А. Голицына и Л. К. Нарышкина.
После провала второго Крымского похода летом 1689 года противоречия между придворными «партиями» достигли апогея. Развязка наступила в ночь с 7 на 8 августа, когда в Преображенское приехали два стрельца, уведомивших Петра о сборе по тревоге ратных людей в Кремле и на Лубянке «неведомо для чего». Испуганный царь с немногими людьми немедленно ускакал из своей резиденции и укрылся в укреплённом Троице-Сергиевом монастыре. Софья же как будто не знала, что предпринять. В эти дни она часто молилась, ходила в окружении стрельцов в Донской и Новодевичий монастыри. Она послала к Петру бояр и патриарха, убеждала брата вернуться, но он отказался. Иоаким остался в Троице, на сторону семнадцатилетнего царя переходили члены государева двора, солдатские и стрелецкие полки, служилые иноземцы.
Софья, наконец, решила сама пойти к брату. Но в селе Воздвиженском посланцы Петра заявили, что если она осмелится двигаться дальше, то с ней «нечестно поступлено» будет. Потерпев неудачу, царевна вернулась в Москву. Она ещё пыталась уговаривать стрельцов, заставляла их целовать крест на верность ей... Но исход придворного конфликта решили стрелецкие командиры, 30 августа явившиеся в Троицу: правительство Софьи потеряло военную опору. Члены Боярской думы потянулись на поклон к Петру I. Сами же стрельцы потребовали выдать на расправу их начальника Шакловитого, а когда гордая царевна отказалась, стали грозить ей мятежом.
В итоге Софья капитулировала. Шакловитый и его «сообщники» были отданы под следствие и 12 сентября казнены. Голицын в решающий момент не смог или не захотел бороться за власть — уехал в свою подмосковную деревню. Затем он тоже явился к Троице, выслушал смертный приговор от имени молодого Петра, а потом и известие о царской милости — ссылке в северный Каргополь. Софья ещё успела послать гонца с письмом и деньгами — последним подарком дорогому Васеньке.
Участь самой царевны также была решена. Младший царь писал брату, что их сестра «государством... умела владеть своею волею», а не по закону и её правление принесло как ущерб обоим государям, так и «народу тягость». Коротко сообщив о злодейских умыслах Шакловитого с сообщниками, в которых те «по розыску и с пытки винились», Пётр изложил главное: «А теперь, государь братец, настоит время нашим обоим особам Богом вручённое нам царствие править самим, понеже пришли есми в меру возраста своего, а третьему зазорному лицу, сестре нашей ц[аревне] С[офье] А[лексеевне], с нашими двемя мужескими особоми в титлах и в росправе дел быти не изволяем... Срамно, государь, при нашем совершенном возрасте тому зазорному лицу государством владеть мимо нас!» Иван не возражал — да и едва ли имел возможность поступить иначе. 7 сентября был издан указ об исключении имени царевны из титулатуры; она официально перестала быть правительницей и «переехала» из Кремля в Новодевичий монастырь.