Жизнь, которую мы создали. Как пятьдесят тысяч лет рукотворных инноваций усовершенствовали и преобразили природу

Пример сорта Флавр Савр ясно показывает, что главный недостаток генной инженерии при посредстве агробактерий – то, что этот метод не годится для введения ДНК в заранее заданное место генома. Плазмида может попасть куда угодно – слишком далеко от гена, с которым ей нужно провзаимодействовать, чтобы получить желаемый результат, или внутрь какого-то гена, где она нарушит что-то важное. В дальнейшем это препятствие удалось преодолеть благодаря новым технологиям – более того, в наши дни появились уже три разные технологии, обеспечивающие точность и целенаправленность редактирования генома. Эти технологии называются «программируемые нуклеазы». Каждую из программируемых нуклеаз можно синтезировать в лаборатории и направить точно в назначенное место в геноме, где она свяжется с цепью ДНК и рассечет ее. Тогда ученые смогут сплайсировать два организма, вставить в геном новую ДНК или еще как-то отредактировать ДНК. Проблема с рестрикционными ферментами состоит в том, что последовательность ДНК, которую они распознают, коротка, обычно всего несколько букв. Рестрикционный фермент, доставленный в клетку, разрезает геном во всех местах, где обнаруживает эту последовательность ДНК из нескольких букв, и в результате получаются тысячи фрагментов. Это никуда не годится. Идеальные «ножницы», разрезающие ДНК для точного редактирования генома, рассекают геном только в одном заданном месте. К счастью, чем длиннее последовательность, которую ножницы запрограммированы распознавать, тем выше точность. Чтобы задать одно нужное место в геноме, обычно хватает последовательности длиной примерно 20 букв ДНК и больше.

Первый инструмент для разрезания ДНК, способный достигать такой точности, появился в 1996 году. Это цинково-пальцевые нуклеазы (ЦПН), созданные из цинковопальцевых белков, каждый из которых распознает последовательность из трех букв ДНК, и рестрикционного фермента (ножницы ДНК) Fok1, не нацеленного ни на какую последовательность (он разрежет что угодно). Цинковопальцевые белки были открыты у лягушек, но есть почти во всех геномах эукариотов, в том числе и в нашем; их задача – связываться с ДНК таким образом, что это меняет экспрессию ближайшего гена. Как только ученые выяснили, как устроены механизмы распознавания и связывания у цинковопальцевых белков, они начали получать в лабораториях новые цинковые пальцы, специально настроенные на то, чтобы связываться с конкретными триплетами ДНК. Вскоре ученые разработали синтетический алфавит цинковопальцевых белков, из которых можно составлять «фразы» для распознавания длинных последовательностей ДНК. В сочетании с рестрикционным энзимом Fok1 цинковопальцевые нуклеазы способны находить точно заданные инженерами места в ДНК, связываться с ней и разрезать ее.

Применение цинковопальцевых нуклеаз в качестве настраиваемого инструмента для редактирования генома стало стандартом в мире науки почти на 15 лет, однако и они не совершенны. Они дорогие, их очень хлопотно создавать, и для этого требуется специализированное оборудование, которое есть далеко не во всех лабораториях. Точность у них хорошая, но этого, однако, недостаточно. Большинство ЦПН запрограммированы на распознавание последовательностей из 18 букв ДНК – по девять букв с каждой стороны от предполагаемого разреза. Вероятно, этого хватает, чтобы точно соответствовать одному участку генома или нескольким участкам, но все же у цинкового пальца остается слишком большое пространство для маневра при распознавании последовательности, а значит, трудно спрогнозировать, будут ли лишние разрезы и сколько их окажется. Кроме того, поскольку не у всякого триплета ДНК есть белок цинкового пальца, некоторые участки генома недоступны для данного метода. Тем не менее ЦПН – это настоящий прорыв в генной инженерии. Они заложили основу для следующего поколения инструментов.

В 2010 году к списку программируемых ножниц для ДНК добавились TALE-нуклеазы (transcription activator-like effector nucleases

). TALE-нуклеазы, как и ЦПН, представляют собой наборы молекул, распознающие специфические буквы ДНК, и Fok1, чтобы разрезать ДНК. Опять же, как и в случае ЦПН, их роль в организмах, где их обнаружили (у бактерий Xanthomonas), заключается в том, чтобы связаться с ДНК и повлиять на экспрессию соседних генов. Однако, в отличие от ЦПН, компоненты TALE-нуклеаз распознают не триплет, а одну-единственную букву ДНК – следовательно, их проще создавать. Беда в том, что молекулы TALE-нуклеаз огромных размеров, и внедрять их в ядро клетки трудно. Но пока ученые работали над этим, появилась третья программируемая нуклеаза, которая изменила все.