Биология. В 3-х томах. Т. 1

Циклическое фотофосфорилирование

При циклическом фотофосфорилировании электроны от Y снова возвращаются на Р700 по цепи переноса электронов. Так же как и при нециклическом фотофосфорилировании, энергия возбуждения электронов используется для синтеза АТФ.

Основные различия между циклическим и нециклическим фотофосфорилированием показаны в табл. 9.5.

Таблица 9.5. Сравнение циклического и нециклического фотофосфорилирования

Нециклическое фотофосфорилирование описывается следующим суммарным уравнением:

При циклическом фотофосфорилировании могут образовываться дополнительные количества АТФ. Эффективность преобразования энергии при световых реакциях очень высока и составляет около 39%.

Реакция Хилла

В 1939 г. Роберт Хилл, работая в Кембридже, обнаружил, что изолированные хлоропласты способны высвобождать кислород в присутствии окислителя (акцептора электронов). С тех пор эту реакцию называют реакцией Хилла. Природный акцептор электронов — НАДФ — можно заменить другими окислителями (они получили название окислителей Хилла). Один из них — голубой краситель ДХФИФ (2,6-дихлорфенолиндофенол), который обесцвечивается после восстановления:

Опыт 9.1. Исследование реакции Хилла

Выделение хлоропластов Материалы и оборудование

Листья шпината, салата или капусты

Ножницы

Предварительно охлажденная ступка с пестиком (либо гомогенизатор или бытовой миксер)

Марля или нейлон

Воронка для фильтрования

Центрифуга и центрифужные пробирки

Водяная баня со льдом и солью

Стеклянная палочка

Растворы (см. примечания ниже)

0,05 М фосфатный буфер, рН 7,0

Среда для выделения

Раствор ДХФИФ (реакционная среда)

Методика

Для выделения хлоропластов можно взять листья шпината, салата или капусты. Листья заливают холодной средой с нужным рН и подходящей осмотической и ионной силой; годится, например 0,4 М раствор сахарозы с 0,01 М КС1 и 0,05 М фосфатным буфером, рН 7,0. Если вы хотите сохранить биохимическую активность, все растворы и необходимые принадлежности надо предварительно охладить и всю работу проводить на холоде и как можно быстрее. Поэтому сначала хорошо разберитесь в методике, а затем уже подготовьте все оборудование.

Если нет возможностей для самостоятельного получения препаратов каждой группой студентов, этим методом можно выделить достаточное количество хлоропластов сразу для нескольких групп.

1. Измельчите ножницами три небольших листочка шпината, салата или капусты (средние жилки и черешки не берите). Залейте в холодную ступку или стакан гомогенизатора 20 мл охлажденной среды для выделения (если надо, пропорционально увеличьте объем измельченной массы и среды) и бросьте туда измельченные листья.

2. Быстро и энергично разотрите листья в ступке (или гомогенизируйте их около 10 с).

3. Положите на воронку четыре слоя марли или нейлона, смочите холодной средой для выделения.

4. Профильтруйте гомогенат через воронку. Фильтрат соберите в охлажденные центрифужные пробирки, помещенные в водяную баню со льдом и солью. Соберите края марли вместе и тщательно отожмите ее в пробирки.

5. Удостоверьтесь в том, что объем фильтрата во всех пробирках одинаков[32].

6. Если ваша настольная центрифуга имеет всего одну постоянную скорость, центрифугируйте фильтрат в течение 2-5 мин (нужно, чтобы появился небольшой осадок, но время осаждения должно быть минимальным).

Если имеется настольная центрифуга, скорость которой можно менять, центрифугируйте фильтрат 1-2 мин при 100-200 g (g — ускорение силы тяжести). Надосадочную жидкость отцентрифугируйте еще раз в течение 5 мин при 1000-2000 g (этого времени достаточно для получения небольшого осадка хлоропластов).

7. Слейте надосадочную жидкость. Налейте в одну из пробирок примерно 2 мл среды для выделения и ресуспендируйте осадок с помощью стеклянной палочки. Полученную суспензию перелейте во вторую пробирку и повторите ресуспендирование. (Если работают несколько групп студентов, то можно налить во все пробирки по 2 мл среды для выделения и дать каждой группе по одной пробирке.)

8. Полученную суспензию хлоропластов держите в водяной бане со льдом и солью и используйте ее как можно быстрее.

Реакция Хилла

Теперь суспензию хлоропластов можно использовать для изучения реакции Хилла. Раствор ДХФИФ должен быть комнатной температуры. Подготовьте четыре пробирки (1-4) и налейте в них соответственно

1) 0,5 мл суспензии хлоропластов + 5 мл раствора ДХФИФ; оставьте пробирку на ярком свету;

2) 0,5 мл среды для выделения + 5 мл раствора ДХФИФ; оставьте пробирку на ярком свету;

3) 0,5 мл суспензии хлоропластов + 5мл раствора ДХФИФ; сразу же спрячьте в темное место;

4) прилейте к 5 мл дистиллированной воды 0,5 мл суспензии хлоропластов. Эта пробирка послужит цветным стандартом: она покажет, какой должна быть окраска суспензии после полного восстановления ДХФИФ. Через 15-20 мин запишите ваши наблюдения.