Биология. В 3-х томах. Т. 1

Если в лаборатории есть колориметр, то за ходом реакции можно проследить, отмечая уменьшение поглощения света красителем по мере изменения его окраски. В окисленном состоянии краситель синий, а в восстановленном бесцветный. В этом случае пробы 2 и 4 следует приготовлять прямо в кюветах колориметра. Поставьте красный (или желтый) светофильтр и установите прибор на ноль, взяв в качестве контроля кювету с пробой 4. Затем быстро приготовьте пробу 1, снимите для нее показания прибора и поставьте кювету с пробой 1 на яркий свет. Дальнейшие измерения делайте через каждые 30 с. Постройте график хода реакции. Как только реакция закончится, измерьте поглощение пробы 3. Самопроизвольное восстановление красителя можно оценить по пробе 2, при этом для установки колориметра на ноль берут в качестве контроля среду для выделения. В идеале для полного восстановления достаточно 10 мин.

Примечания

Приготовьте следующие растворы:

0,05 М фосфатный буфер, рН 7,0

Na₂HPО₄·12Н₂О 4,48 г (0,025 М)

КН₂РО₄ 1,70 г (0,025 М)

Доведите дистиллированной водой до 500 мл и поставьте в холодильник (0-4°С).

Среда для выделения

Сахароза 34,23 г (0,4 М)

КС1 0,19 г (0,01 М)

Растворите все в фосфатном буфере при комнатной температуре и доведите буфером до 250 мл. Держите среду в холодильнике при 0-4°С.

Раствор ДХФИФ (реакционная среда)

ДХФИФ 0,007-0,01 г (~ 10^-4 М)

КС1 0,93 г (0,05 М)

Растворите в фосфатном буфере при комнатной температуре и доведите объем до 250 мл. Храните в холодильнике при 0-4°С. Используйте при комнатной температуре. (Хлорид калия — кофактор реакции Хилла.)

9.8. Заметили ли вы какие-нибудь изменения в пробирке 1?

9.9. Для чего были нужны пробирки 2 и 3?

9.10. Какие другие органеллы помимо хлоропластов могут, по вашему мнению, попасть в суспензию?

9.11. Из чего видно, что они не участвуют в восстановлении красителя?

9.12. Почему среду для выделения надо держать на холоде?

9.13. Для чего забуферивают среду для выделения?

9.14. Что служит а) донором и 6) акцептором электронов в реакции Хилла?

9.15. При реакции Хилла ДХФИФ действует на участке между X и ФС I в Z-схеме (рис. 9.15), и при этом выделяется кислород. Связана ли реакция Хилла с циклическим или с нециклическим фотофосфорилированием или же с тем и другим? Обоснуйте ваш ответ.

9.16. На рис. 9.16 показано, как выглядят хлоропласты после описанного выше опыта: вид но, к чему приводит перенос их из гипертонической среды выделения в гипотоническую реакционную среду.

Рис. 9.16. Электронная микрофотография хлоропластов после выделения их в гипотонической среде; × 13485. Оболочки и строма утрачены

а) Чем хлоропласты на рис. 9.16 отличаются по внешнему виду от нормальных хлоропластов?

б) Можете ли вы объяснить, почему перенос хлоропластов в среду без сахарозы приводит к таким изменениям?

в) Почему желательно, чтобы эти изменения произошли в нашем опыте до реакции Хилла?

9.17. Как вы думаете, какое значение имело открытие реакции Хилла для понимания фотосинтетического процесса?

9.4.3. Темновые реакции

Для темновых реакций, которые протекают в строме, свет не нужен. Восстановление СО₂ происходит за счет энергии (АТФ) и восстановительной силы (НАДФ·Н₂), образующихся при световых реакциях. Темновые реакции контролируются ферментами. Последовательность этих реакций была определена в США Кальвином, Бенсоном и Бэссемом в период с 1946 по 1953 г.; в 1961 г. Кальвину была присуждена за эту работу Нобелевская премия.

Эксперименты Кальвина