В июне 1866 года, не дожидаясь окончания следствия, власти начали подготовку к судебному рассмотрению дела. На начальном этапе предстояло ответить на вопрос: можно ли проводить судебные слушания, опираясь на недавно принятый Устав уголовного судопроизводства 1864 года, что означало проведение состязательного процесса с участием формально равноправных сторон обвинения и защиты. Однако исключительность случая покушения на священную персону императора и производство следственных действий по старым правилам побуждали следовать прежнему порядку. Министр юстиции Д. Н. Замятнин, руководитель и активный сторонник судебной реформы, настаивал на применении новых правил. Его поддерживал вице-председатель Государственного Совета князь П. П. Гагарин. В итоге Александр II склонился к их мнению, начертав резолюцию:
28 июня (10 июля) 1866 года для судебного разбирательства по делу Каракозова, Ишутина и других учрежден был Верховный уголовный суд. Согласно императорской резолюции, председателем суда стал князь Гагарин, остальную судебную коллегию составили судьи, специально назначенные для рассмотрения этого дела. Обвинение в ходе судебных слушаний поддерживал министр юстиции Замятнин. На скамье подсудимых оказались, помимо Каракозова и Ишутина, другие активные участники ишутинской «Организации»: А. А. Кобылин, И. А. Худяков, Н. П. Странден, Д. А. Юрасов и другие — всего 36 человек.
Судебные заседания проводились в закрытом режиме в комендантском доме на территории Петропавловской крепости. Помещения комендантского дома уже в третий раз принимали громкое судебное следствие: ранее там же слушались дела декабристов (1826 год) и петрашевцев (1849 год). Подсудимым предоставили возможность пригласить защитника по собственному выбору. Ишутин выбрал защитником присяжного поверенного [адвоката. —
От начала судебной реформы прошло всего два года, и состязательность всем была еще в новинку. Еще необычнее по меркам времени выглядел судебный процесс, в котором по новым правилам слушалось преступление против священной особы государя. До реформы такие преступления были бы рассмотрены кулуарно без какой-либо надежды для подсудимых донести до судей свое мнение. Необычность «каракозовского процесса» наглядно иллюстрирует, в частности, вопрос члена судейской коллегии П. Г. Ольденбургского к защитнику Ишутина Стасову:
Поначалу планировалось в первоочередном порядке провести судебные слушания в отношении 11 подсудимых, наиболее вовлеченных в планы цареубийства. Такова была просьба императора. Александр II желал завершить дело Каракозова как можно скорее, поскольку ожидал приезда в столицу невесты наследника и не хотел омрачать празднества обвинительными приговорами и казнями. Затем ввиду перекрестного участия в качестве свидетелей одних подсудимых в делах против других суд принял решение
Последний находился на скамье подсудимых по подозрению в пособничестве. Обучаясь медицинскому делу, Кобылин имел доступ к различным ядам, которые он мог как по своей воле передать Каракозову, так и проявить небрежность, позволив этим ядам попасть в его руки, так, что в конечном итоге они были обнаружены при Каракозове в момент задержания. Показания этих двоих во многом противоречили друг другу, и при совместном рассмотрении дела судебная комиссия рассчитывала эти противоречия устранить.
Каракозов обвинялся в покушении на жизнь императора и принадлежности к тайному обществу «Ад», имевшему целью цареубийство. В судебном заседании был зачитан текст обнаруженной у него при задержании прокламации «Друзьям рабочим», в которой Каракозов объяснял мотивы своих действий: