Генетический детектив. От исследования рибосомы к Нобелевской премии

Я сказал, что у меня он может продолжить работу над этим белком, но на самом деле я нацеливаюсь на субъединицу 30S. Думал, что он отнесется к этому скептически, особенно когда узнает, что большая и хорошо финансируемая группа Ады в Германии много лет не может взломать ее структуру. Меня приятно удивило, что он загорелся этой идеей. Я предложил ему для начала взяться за пару мелких белков, чтобы он освоил основы расшифровки структур. В последующие годы энергия и оптимизм Била, а также его готовность пробовать новые и нестандартные подходы оказались бесценными.

Следующим ко мне присоединился Брайан Уимберли. Он обращался ко мне с просьбой о работе еще в Брукхейвене, но я переезжал в Юту, и поэтому он связался со мной год спустя. Диссертацию он защитил в Университете Беркли под руководством Игнасио (Начо) Тиноко, где пользовался нетипичным методом ЯМР (ядерно-магнитный резонанс), чтобы показать структуру фрагмента РНК в рибосоме. Работая в постдокторантуре в Исследовательском институте Скриппса в Ла-Хойе, он занимался изучением белков, связывающихся с кальцием, но его интерес к РНК не пропал. К концу пост-докторантуры ему пришлось выбирать между штатной преподавательской должностью в Технологическом институте штата Джорджия и повторной постдокторантурой по изучению кристаллографии. Я был рад пригласить к себе Брайана, имевшего реальный опыт работы с РНК, – сам я знал о РНК сравнительно немного, несмотря на то, что из нее на две трети состоит рибосома.

Мы сразу сработались. Я рассказывал ему, какое отличное и безопасное место город Солт-Лейк-Сити, но когда на следующее утро мы вышли на улицу, то обнаружили побитые стекла на машинах. Я заволновался, что Брайан захочет уехать, но, к счастью, Вера пригласила его на прогулку в холмы вокруг Солт-Лейк-Сити, где они прекрасным весенним утром смотрели на красоты дикой природы. Брайану нравились пешие прогулки и отдых на свежем воздухе, поэтому вопрос о переезде для него был решен.

Затем присоединиться к моему коллективу захотел Джон Маккатчен – смышленый, дерзкий и амбициозный студент из Висконсина. Я думал, что он мог бы начать работать вместе с Брайаном над кристаллизацией рибосомного белка, связывающегося с небольшим, четко определенным фрагментом РНК, но он вскоре счел эту работу слишком простой и быстро решил хоть костьми лечь, но потрудиться над расшифровкой 30S. Определенно, тот факт, что ни Бил, ни Джон особо не разбирались ни в кристаллографии, ни в рибосомах, только помог мне убедить их, что это отличный диссертационный проект.

Рис. 9.1

. Лаборатория автора в Юте. На снимке: автор, Джоанна Мэй, Боб Датнолл, Брайан Уимберли, Джон Маккатчен и Бил Клемонс (публикуется с разрешения Исао Танаки)

Проблема была в том, с чего начать. Кристаллы субъединицы 30S, о получении которых впервые сообщила советская группа Гарбер, были взяты от Thermus Thermophilus

. Но с момента их получения минуло почти десять лет, и по-прежнему не удавалось добиться достаточно хорошей дифракции, чтобы рассмотреть их атомную структуру.

Размышляя о том, как можно доработать эти кристаллы, я вспомнил лекцию Иоахима Франка, прочитанную в Виктории. Он не только показал изображения целой рибосомы с тРНК, но и продемонстрировал, что контуры субъединицы 30S, рассмотренные в составе рибосомы и отдельно, слегка отличаются. Напрашивался вывод, что ее молекулы гибкие. Субъединицу описывали в антропоморфном ключе; говорили, что у нее есть «головка», соединенная с основной частью, «телом», тонкой «шейкой». Причем отличия наблюдались именно в «головке» – она как будто колыхалась. Такая подвижность головки критически важна для того, чтобы тРНК могли передвигаться по рибосоме. Но гибкость – проблема для кристаллографии, ведь необходимо, чтобы все молекулы укладывались в кристаллической решетке одинаково. Возможно, думал я, чтобы синтезировать качественные кристаллы субъединицы 30S, надо как-то зафиксировать головку.

В рибосоме есть белок, помогающий ей начать движение по мРНК с нужной позиции, который называется фактором инициации 3 или IF3. Он должен прикрепляться между головкой и телом молекулы. В мой последний год в Брукхейвене мы как раз расшифровали его структуру, поэтому именно о нем я и думал. Я предложил Джону Маккатчену заблокировать субъединицу 30S, прикрепив к ней IF3, а затем попробовать ее кристаллизовать.

Мы с помощью Боба Датнолла на хроматографической колонке очистили субъединицы 30S, в частности от ферментов-рибонуклеаз и протеаз, которые могли повредить рибосому, разлагая ее РНК или белок. Это было важно по двум причинам: в таком состоянии субъединицы 30S могли неделями покоиться в капельках, причем в процессе удалялся рибосомный белок S1, связанный с рибосомой слабее, чем остальные белки. В результате у нас получались очень чистые образцы 30S.