Интернет-журнал "Домашняя лаборатория", 2008 №6

Хроматографический метод анализа впервые был применен русским ботаником М. С. Цветом в 1903 г. для разделения хлорофиллов и других растительных пигментов. Разделение пигментов М. С. Цвет проводил в стеклянной колонке (трубке), наполненной сухим твердым адсорбентом (СаСО₃). Первым этапом процесса разделения была экстракция пигментов из растительных материалов органическим растворителем. Полученный экстракт вводили в колонку, которую затем промывали (элюировали) органическим растворителем. Компоненты экстракта перемещались по колонке с различной скоростью, образуя отдельные окрашенные кольца. После полного разделения компонентов влажный адсорбент извлекали из колонки, полученный столбик разрезали на отдельные полосы, экстрагировали вещество, упаривали и исследовали остаток.

Современные хроматографические методы разделения имеют очень большие возможности и считаются классическими методами разделения органических и неорганических веществ. Эти методы позволяют разделять органические соединения, имеющие сходные структуры, и неорганические соединения с близкими химическими свойствами.

Хроматографические методы широко применяют в различных отраслях науки и техники, в том числе в биохимии и молекулярной биологии. Хроматографические методы используются для решения следующих задач:

• разделение сложных смесей неорганических и органических веществ;

• выделение индивидуальных веществ (белков, углеводов, витаминов, ферментов, липидов, аминокислот, органических кислот, антибиотиков и др.) из сложных смесей;

• очистка индивидуальных веществ от примесей;

• концентрирование веществ из сильно разбавленных растворов, и др.

Хроматография основана на распределении компонентов смесей веществ между двумя несмешивающимися фазами — неподвижной и подвижной. В качестве неподвижной фазы используют твердое вещество или жидкость, нанесенную на твердый инертный носитель. Подвижной фазой служит газ или жидкость, которые содержат смесь разделяемых веществ. В зависимости от природы содержащей вещество фазы различают газовую (ГХ) и жидкостную (ЖХ) хроматографии. Различие в природе носителя удваивает каждый класс — в результате получаем 4 основных типа хроматографии — газовую твердофазную (ГТХ) и газовую жидкостную (ГЖХ), а также жидкостную твердофазную

(ЖТХ) и жидкость-жидкостную (ЖЖХ). Другое название ЖТХ — препаративная колоночная хроматография.

Хроматографическое разделение основано на том, что отдельные компоненты смеси перемещаются по колонке с различной скоростью и достигают выхода через разные промежутки времени.

Растворитель (или газ), проходящий через колонку, называют элюентом

, процесс перемещения вещества вместе с элюентом — элюированием. Разработаны методы обнаружения и количественного определения разделяемых соединений, которые не обязательно должны быть окрашены. В современной колоночной хроматографии твердую фазу, как правило, не извлекают из колонки, а элюирование проводят до тех пор, пока отдельные вещества не выйдут одно за другим из колонки. Каждый компонент регистрируют непосредственно на выходе из колонки с помощью разнообразных методов (фотометрических, потенциометрических, рефрактометрических и др.) или же фракции компонентов смеси собирают коллектором, затем в отобранных фракциях элюата определяют количество исследуемого вещества, выбирая метод, пригодный для этой цели. Препаративная колоночная хроматография является одним из самых эффективных методов выделения органических веществ и разделения их смесей, однако соответствующие эксперименты требуют длительного времени, осуществление их в органическом практикуме проблематично и в настоящем пособии рассмотрено не будет.

Следует остановиться на лишь на двух хроматографических методах, могущих найти применение в органическом практикуме. Это — аналитическая газо-жидкостная хроматография (ГЖХ) и тонкослойная хроматография (ТСХ). Оба метода находят используются для контроля за протеканием реакций и определения степени чистоты синтезированных соединений.

Газо-жидкостная хроматография

Разделение летучих смесей в газовой хроматографии проводят в специальных приборах — хроматографах. Выбор газа-носителя зависит от типа детектора. Скорость потока газа устанавливают постоянной. Разделяемую смесь вводят в колонку с помощью дозирующего устройства (обычно микрошприца). Ее количество обычно невелико и составляет 1 мкл -0.1 % раствора (порядка 1 мкг вещества). В системе ввода поддерживают такую температуру, которая обеспечивает испарение образца, затем вместе с газом-носителем введенный газообразный образец попадает в колонку, где происходит разделение компонентов. Эта колонка заполнена твердым носителем, на который нанесен тонкий слой нелетучей органической жидкости. Эта жидкость и служит неподвижной фазой.