Зыбкой ситуацией решили воспользоваться несколько бояр во главе с князем Василием Ивановичем Шуйским. Они организовали заговор против Лжедмитрия. В период свадебных торжеств обстановка в Москве накалилась, и ранним утром 17 мая 1606 года заговорщики проникли в Кремль. Отрепьева и Марину застигли врасплох. «Разом во всех церквах ударили в набат. Тогда из всех углов побежали толпами сотни и тысячи человек, кто с дубинками, кто с ружьями, кто с обнажёнными саблями, с копьями или с тем, что попало им под руку. Все они бежали к Кремлю. Сильно перепуганный Дмитрий швырнул в комнату свой палаш, стал рвать на себе волосы и, ничего не сказав, ушёл от немцев в свою спальню. Те бросились в соседнюю комнату и заперлись, но царя уже не было. Он ушёл из своей спальни потайным ходом, пробежал мимо царицыных покоев в каменный зал, где со страху выпрыгнул в окно с высоты 15 сажень на пригорок и спасся бы, если бы не вывихнул ногу» (Конрад Буссов). Тут его настигли и убили.
Труп «царя Дмитрия Ивановича» выволокли за Спасские ворота. Потом привели инокиню Марфу, бывшую царицу Марию Нагую. Она тут же отреклась от самозванца. Тело Отрепьева сожгли, а пеплом, по легенде, зарядили пушку, выстрелившую в ту сторону, откуда пришёл Лжедмитрий на Москву. Дочь польского воеводы Марину арестовали и отправили в ссылку в Ярославль. В другие города под надзор выслали и польских шляхтичей из окружения самозванца.
Так закончилась авантюра «воскресшего из мёртвых» царевича. Гибель Лжедмитрия I означала падение престижа царской власти. Монарх уже не внушал прежнего трепета. Царя можно было свергнуть, а можно и убить. Тем самым открывался простор для последующих бесчинств Смутного времени.
Через два дня после гибели расстриги сторонники Василия Шуйского созвали импровизированный Земский собор. На нём Шуйский был «выкликнут» московским царём и стал вторым избранным правителем в русской истории. Царь Василий Иоаннович дал крестоцеловальную запись — грамоту, в которой обязался сохранять привилегии боярства, не налагать опалы и не казнить без суда, не отнимать боярские вотчины без согласия Думы, то есть править в соответствии с интересами боярской верхушки. Но и другие подданные получали гарантии своих прав. Шуйский, таким образом, принёс первую в истории России присягу своему народу.
Новый царь не отличался особенными достоинствами. Этот маленький, подслеповатый, тщедушный человек главным орудием своей политики избрал хитрость и интригу. Он неоднократно менял убеждения в зависимости от обстоятельств, был подозрителен и лицемерен. Внушал скорее презрение, чем уважение. «Царь Василий ростом мал, некрасив, очи имел подслеповатые; в книжном учении сведущ, рассудителен и разумен; скуп очень и неотзывчив; единственно к тем благоволил, кто нашёптывал ему ложное на людей, он же их слушал с удовольствием и радостью; любил гадать у волхвов, а о воинах своих не радел» («Летописная книга» Катырева-Ростовского). Не обладая талантами государственного деятеля, Василий Иванович в критический момент встал во главе государства и не сумел установить в нём порядок и покой.
Чтобы пресечь всевозможные слухи о спасшемся царевиче, Шуйский организовал торжественное перенесение останков подлинного Дмитрия из Углича в Архангельский собор Московского кремля. По его настоянию, погибший царевич был причислен Русской православной церковью к лику святых. Во главе церкви вместо смещённого Игнатия теперь встал новый патриарх — казанский митрополит Гермоген. Теперь любое выступление «под знамёнами царевича Дмитрия» выглядело не просто самозванством, но и кощунством. Примкнувший же к мятежникам становился еретиком, дерзнувшим сомневаться в мученичестве святого царевича. Но это не остановило буйные головы на окраинах страны. Против царя Василия выступили воеводы некоторых городов, где уже зрели новые ростки смуты.
Призрак Лжедмитрия не давал покоя растревоженной стране. Он вновь стал знаменем и дворянской оппозиции, и широких народных масс. Нашёлся и новый вождь движения — Иван Исаевич Болотников. Сам он был, вероятно, мелким дворянином, но служил военным холопом у князя Андрея Телятевского. Болотников побывал в крымском и турецком плену, несколько лет рабски трудился гребцом на галере, потом был захвачен немцким кораблём. В Европе скитался из страны в страну, успев повоевать против турок на службе у австрийского императора. Наконец, попал в Речь Посполитую. Здесь он оказался в городе Самборе и в замке Мнишеков встретился с двойником Отрепьева — Михаилом Молчановым, бежавшим из Москвы и выдававшим себя за чудом спасшегося царя Дмитрия. От Молчанова Болотников получил грамоту, скреплённую украденной из Москвы государственой печатью, в которой назначался воеводой «царя», и небольшую денежную сумму.